一种水稻细菌性穗枯病的快速诊断方法技术

一种水稻细菌性穗枯病的快速诊断方法，属于植物病害诊断技术领域。其包括以下步骤：a）田间症状的调查；b）病原的分子检测。与现有技术相比，本发明专利技术具有以下有益效果：a）本发明专利技术田间症状调查时，根据水稻细菌性穗枯病的典型症状：不仅谷粒早期缺水状萎凋的苍白色，中后期褐化腐坏，而且叶鞘有褐色条斑，进行初步诊断，能快速区分该病和其他穗部病害。b）本发明专利技术以仅存在

A rapid diagnostic method for bacterial ear blight of rice

A rapid diagnostic method for bacterial ear blight of rice belongs to the field of plant disease diagnosis technology. It includes the following steps: a) investigation of field symptoms; b) molecular detection of pathogens. Compared with the prior art, the invention has the following advantages: a) the symptom of field investigation, according to the typical symptoms of bacterial blight of Rice Panicle: not only grain early water like pale in late withering, browning and decay, leaf sheaths brown streak, the initial diagnosis can rapidly distinguish the disease and the other ear disease. B) the present invention only exists

【技术实现步骤摘要】
一种水稻细菌性穗枯病的快速诊断方法
本专利技术属于植物病害诊断
，具体涉及一种水稻细菌性穗枯病的快速诊断方法。
技术介绍
水稻细菌性穗枯病（Bacterialpanicleblightofrice，BPBR）是新上升的世界性的重要水稻病害，其病原为颖壳伯克氏菌（Burkholderiaglumae），主要危害水稻的幼苗和谷穗。病原菌侵染幼苗，先在秧苗病叶出现水渍状斑，后变为褐色，感病严重的幼苗腐烂。病原菌侵染谷粒，开始呈现似缺水状萎凋的苍白色，后来渐渐变为黄褐色或深褐色，颖壳颜色也发生变化，表现为内外颖尖端或基部呈紫褐色，护颖呈暗紫褐色；同时叶鞘部位有褐色条斑。BPBR于1956年首次在日本九州发现，1970年代后期日本实行水稻机械化生产而大面积工厂化育秧，导致BPBR大流行，成为日本水稻上最严重的病害之一。1980年代该病害仅在2个亚洲国家发生，到2012年，包括亚洲、非洲、北美和南美洲的17个国家均有发生甚至爆发流行的报道，在美国稻区尤为严重，最高产量损失达80%。2007年，水稻细菌性穗枯病在中国被列为检疫性病害，但近年来由于气候改变、水稻品种（组合）的更换、耕作栽培制度的变化等因素，该病目前正在中国发生和蔓延。但由于它是检疫性病害，广大农技人员和农民对它的认识不够；另一方面，真菌性穗枯病，穗腐病，稻粒黑粉等都能引起细菌性穗枯病相似的症状（谷粒的瘪壳，褐化和腐坏）；农技人员和农民不能有效地辨别和诊断。这都阻碍了该病的及时精准的防治，导致水稻减产减质。因此急需建立水稻细菌性穗枯病的快速诊断方法。在实现本专利技术过程中，专利技术人发现现有技术中至少存在如下问题：已有的研究表明真菌性穗枯病，穗腐病，稻粒黑粉也会产生谷粒褐化腐坏的症状，和细菌性穗枯病症状类似，仅凭田间症状难以准确诊断。在利用PCR方法检测病原菌的实验中，由于B.glumae和其他伯克氏菌B.gladioli、B.plantarii等基因组序列同源性极高，设计的引物特异性不够，不能有效区分这几种伯克氏菌；另外，在做PCR检测的时候，一般先从感病样品上分离病原菌，再提取病原菌DNA做模板进行PCR反应，费时费力。这些都为水稻细菌性穗枯病的快速诊断造成巨大干扰。
技术实现思路
针对现有技术存在的问题，本专利技术的目的在于设计提供一种水稻细菌性穗枯病的快速诊断方法的技术方案。所述的一种水稻细菌性穗枯病的快速诊断方法，其特征在于包括以下步骤：a）田间症状的调查根据田间病害的群体表现：有发病中心，由点到面的逐步发生病害，确定为病原菌引起的侵染性病害；根据田间水稻病害穗期的个体症状：抽穗早期谷粒缺水状萎凋的苍白色，中后期褐色腐坏，并且叶鞘部位有褐色条斑，初步诊断为水稻细菌性穗枯病；b）病原的分子检测采集田间典型疑似症状的样品，选取褐化腐坏谷粒10粒，先使用酒精和次氯酸钠溶液依次消毒，无菌水冲洗；然后采用无菌的剪刀剪碎谷粒，加10mL无菌水，用无菌的镊子挤压谷粒3-5min，吸取一定量的谷粒浸出液为模板和特异性引物BGF/BGR直接进行PCR反应，琼脂糖胶检测PCR扩增产物；最后对目标扩增产物进行测序，将测序的序列与Genbank中已有序列进行比对，获得检测样品种属信息。所述的一种水稻细菌性穗枯病的快速诊断方法，其特征在于所述的酒精溶液为浓度70%酒精水溶液。所述的一种水稻细菌性穗枯病的快速诊断方法，其特征在于所述的次氯酸钠溶液为浓度1%的次氯酸钠水溶液。所述的一种水稻细菌性穗枯病的快速诊断方法，其特征在于所述的PCR反应中PCR模板的量为：10mL谷粒浸出液中的10μL。所述的一种水稻细菌性穗枯病的快速诊断方法，其特征在于所述的特异性引物BGF的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示，所述的特异性引物BGR的核苷酸序列如SEQIDNo.2所示。所述的一种水稻细菌性穗枯病的快速诊断方法，其特征在于所述的PCR体系为：10μL谷粒浸出液，然后加入特异性引物BGF/BGR1.5μL，2XKODFX缓冲液10μL，2.5mMdNTPs3μL，KODDNApolymerase0.5μL；反应条件为：95℃，5min；98℃10s，55℃30s，68℃50s，35个循环；68℃，7min。与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：a）本专利技术田间症状调查时，根据水稻细菌性穗枯病的典型症状：不仅谷粒早期缺水状萎凋的苍白色，中后期褐化腐坏，而且叶鞘有褐色条斑，进行初步诊断，能快速区分该病和其他穗部病害。b）本专利技术以仅存在B.glumae的基因序列设计引物，PCR产物特异性强，检测结果精准度高。c）本专利技术通过田间样本浸出液直接为模板进行PCR，不必分离病原菌再抽提DNA,大大缩短了诊断时间。d）本专利技术水稻细菌性穗枯病的诊断方法简单、快速、准确。附图说明图1是本专利技术实施例水稻细菌性穗枯病田间疑似样品的典型症状。A:大田症状；B:大田五点采集的感病单株穗部症状。图2是本专利技术实施例水稻细菌性穗枯病田间疑似样品的PCR鉴定。引物为BGF/BGR，目标片段400bp。LaneM:TakaraDL2000marker；Lane1:正常水稻样品；Lane2-6:大田五点采集的感病单株谷粒样品。图3是本专利技术实施例水稻细菌性穗枯病田间疑似样品的PCR产物同源性比对结果。LMG2196为国际通用的B.glumae标准菌株；FY1-5：大田五点采集的感病单株谷粒样品。利用特异性引物BGF/BGR扩增的来自FY1-5的产物的序列blast结果显示与LMG2196同源性100%。具体实施方式下面结合一个具体实施例进行说明。为使本专利技术实施方式的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本专利技术实施方式中的附图，对本专利技术实施方式中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施方式是本专利技术一部分实施方式，而不是全部的实施方式。基于本专利技术中的实施方式，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本专利技术保护的范围。水稻细菌性穗枯病是新上升的世界性重要水稻病害，在亚洲、非洲、北美和南美洲均有细菌性穗枯病爆发和流行的报道，最高产量损失达80%。2007年，水稻细菌性穗枯病在中国被列为检疫性病害。但是近年该病正在中国发生和蔓延。本实施例是在早稻抽穗灌浆期，发现中国水稻研究所杭州富阳实验基地某些田块疑似有水稻细菌性穗枯病发生。于是通过田间症状调查和分子检测对是否是该病作出快速诊断。a）田间症状的调查首先根据田间病害的群体表现：是否有发病中心；是短时间同时发生还是由点到面的逐步发生，确定是侵染性还是非侵染性病害。然后观察田间水稻病害穗期的个体症状：抽穗早期谷粒缺水状萎凋的苍白色，中后期黄褐色或深褐色。区别于其他穗部病害最重要的症状：叶鞘部位是否有褐色条斑。b）病原的分子检测采集田间典型疑似症状的样品，选取褐化腐坏谷粒10粒，先使用70%酒精和1%氯酸钠溶液依次消毒，无菌水冲洗；然后采用无菌的剪刀剪碎谷粒，加10mL无菌水，用无菌的镊子挤压谷粒3-5min，吸取一定量的谷粒浸出液为模板和特异性引物BGF/BGR（仅存在B.glumae的基因序列）直接进行PCR反应，PCR体系为：10μL谷粒浸出液，然后加入特异性引物BGF/BGR1.5μL，2XKODFX缓冲液10μL，2.5mMdNTPs本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种水稻细菌性穗枯病的快速诊断方法，其特征在于包括以下步骤：a）田间症状的调查根据田间病害的群体表现：有发病中心，由点到面的逐步发生病害，确定为病原菌引起的侵染性病害；根据田间水稻病害穗期的个体症状：抽穗早期谷粒缺水状萎凋的苍白色，中后期褐色腐坏，并且叶鞘部位有褐色条斑，初步诊断为水稻细菌性穗枯病；b）病原的分子检测采集田间典型疑似症状的样品，选取褐化腐坏谷粒10粒，先使用酒精和次氯酸钠溶液依次消毒，无菌水冲洗；然后采用无菌的剪刀剪碎谷粒，加10mL无菌水，用无菌的镊子挤压谷粒3‑5min，吸取一定量的谷粒浸出液为模板和特异性引物BGF/BGR直接进行PCR反应，琼脂糖胶检测PCR扩增产物；最后对目标扩增产物进行测序，将测序的序列与Genbank中已有序列进行比对，获得检测样品种属信息。

【技术特征摘要】
1.一种水稻细菌性穗枯病的快速诊断方法，其特征在于包括以下步骤：a）田间症状的调查根据田间病害的群体表现：有发病中心，由点到面的逐步发生病害，确定为病原菌引起的侵染性病害；根据田间水稻病害穗期的个体症状：抽穗早期谷粒缺水状萎凋的苍白色，中后期褐色腐坏，并且叶鞘部位有褐色条斑，初步诊断为水稻细菌性穗枯病；b）病原的分子检测采集田间典型疑似症状的样品，选取褐化腐坏谷粒10粒，先使用酒精和次氯酸钠溶液依次消毒，无菌水冲洗；然后采用无菌的剪刀剪碎谷粒，加10mL无菌水，用无菌的镊子挤压谷粒3-5min，吸取一定量的谷粒浸出液为模板和特异性引物BGF/BGR直接进行PCR反应，琼脂糖胶检测PCR扩增产物；最后对目标扩增产物进行测序，将测序的序列与Genbank中已有序列进行比对，获得检测样品种属信息。2.如权利要求1所述的一种水稻细菌性穗枯病的快速诊断方法，其特征在于所述的酒精溶液为浓度70%酒精水...

【专利技术属性】
技术研发人员：侯雨萱，黄世文，徐以华，
申请(专利权)人：中国水稻研究所，
类型：发明
国别省市：浙江,33