高效合成融合基因的方法及其应用技术

本发明专利技术涉及一种高效合成融合基因的方法及其应用，合成融合基因的方法包括如下步骤：分析待合成融合的基因序列，确定适合进行退火的区域；根据适合进行退火的区域而选择合适长度的片段，进行各个片段的引物的设计与合成；混合合成的各个片段的引物，然后进行重叠PCR，将各个片段的引物拼接成，得到拼接产物，即为合成融合得到的基因。本发明专利技术提供的高效合成融合基因的方法，可以提高重叠PCR反应的效率和成功率，一次成功率高达100％，远远高于现有技术中的重叠PCR的一次成功率70％～80％，免去了需要多次尝试PCR条件、改变反应体系中离子强度和添加剂、反应温度等繁琐的优化步骤，大大降低了成本。

Highly efficient synthesis of fusion gene and its application

The invention relates to a method for efficient synthesis of fusion gene and its application, synthesis method comprises the following steps: fusion gene sequence analysis to synthetic fusion, determine suitable annealing region; and select the appropriate length for annealing of the fragments according to the region, the design and synthesis of primers for each fragment of each primer mixture; fragment synthesized, then PCR will overlap, each primer fragment into a mosaic, mosaic products, which is synthesized from the fusion gene. The invention provides methods for efficient synthesis of fusion gene, can improve the efficiency and success rate of overlapping PCR reaction, a success rate of 100%, far higher than the existing technology in the overlapping PCR a success rate of 70% to 80%, which eliminates the need to repeatedly try PCR conditions, change the optimization steps in the reaction system of ion complex strength and additives, reaction temperature, greatly reducing the cost.

【技术实现步骤摘要】
高效合成融合基因的方法及其应用
本专利技术涉及基因合成
，具体涉及一种高效合成融合基因的方法及其应用。
技术介绍
当前基因合成主要的方法为两步合成法，第一步是利用PCR(聚合酶链式反应)的方法将引物拼接形成200～800bp(碱基对)的小片段，经过测序验证无误后通过将片段拼接成更长的所需片段。常用的将小片段拼接成长片段的方法有连接法，重叠PCR方法，体外重组法等。目前应用最广泛的是重叠PCR的方法。在该方法中，两个需要拼接的片段有一个重叠区，可以用于重叠PCR反应时的退火。而在片段的另外两端分别设计扩增全长的引物，在PCR反应体系中，一个片段将可以利用另外一个片段作为模板延伸，从而得到拼接后的全长的片段序列，而最后扩增全长的引物将整个的全长片段进行扩增得到足够量以进行后续的克隆工作。重叠PCR反应的成功与否是得到全长拼接片段的关键。由于目前对重叠PCR反应的影响因素并没有系统的研究与优化，因此重叠反应在日常拼接中的成功率并不高，大约在80％左右。而大部分的优化集中在对重叠PCR反应体系的改变上面。比如使用不同供应商、不同特性的聚合酶；在反应的缓冲液体系中加入不同浓度的镁离子；使用不同对的退火温度等。这些方法没有一个明确的指导原则，没有明确的优化参数可以进行方向性的判断，基本上是一个试错的过程，因而费时费力。
技术实现思路
本专利技术提供了一种合成融合基因的方法，包括如下步骤：S1：分析待合成融合的基因序列，确定适合进行退火的区域；S2：在适合进行退火的区域中选择合适长度的片段，进行各个片段的引物的设计与合成；S3：混合合成的各个片段的引物，然后进行重叠PCR，将各个片段的引物拼接成，得到拼接产物。需要说明的是，S3中，引物分离纯化后可以进行克隆测序后验证。为了提高片段之间的退火效率，从而提高片段的拼接成功率，本专利技术针对影响退火的序列进行了分析、结合PCR引物的设计原则来优化片段的分段原则。从PCR引物的设计原则借鉴中发现以下因素同样影响待拼接片段之间的重叠区域的有效性：(1)碱基的比例，也就是重叠区中AT与GC的比例，理想的情况下保持AT与GC的比例在接近1：1有利于片段的退火；(2)区域中复杂的二级结构区域，包括回文区与重复区域等，这些复杂二级结构影响有效的退火；(3)存在过多的连续碱基，比如类似AAAAAAAA等的连续区域。目前该领域的多种常用分子生物学软件均能分析目的序列并能发现以上的这些序列特征，比如Primer3、Oligo、DNAStar等商业化或开源的免费工具，均能用于发现上述不利的序列因素，从而在后续的拼接片段分段中通过项目设计者来主动避免，因而有效避免了以往的无指导分段的弊端。在本专利技术的进一步实施方式中，S1中，确定适合进行退火的区域是根据退火温度确定，退火温度为60℃。需要说明的是，退火的区域可以根据需要的Tm(退火温度)决定，通常认为最佳的Tm为55℃～60℃。在本专利技术的进一步实施方式中，S1中，确定适合进行退火的区域是根据Primer3、Oligo或DNAStar等工具进行确定。在本专利技术的进一步实施方式中，S2中，合适长度为200～800bp，且保证各片段之间的重叠区域为适合进行退火的区域。需要说明的是，根据适合区域在片段中的位置，选择合适的长度，注意保持该长度在适合的第一步合成的片段长度范围之内，比如(200～800bp)，保证各片段之间的重叠区域为上述选择出的合适退火区，然后按照常规方法进行各个片段引物的设计。在本专利技术的进一步实施方式中，在S3后，还包括S4：将拼接产物进行克隆，测序验证序列正确性。在本专利技术的进一步实施方式中，S3中，重叠PCR采用Lifetechnologies公司的PlatinumHifi聚合酶及反应体系，当然其它供应商的类似高保真聚合酶也可使用。本专利技术还保护上述合成融合基因的方法在高通量测序基因诊断中融合基因标准品构建中的应用。本专利技术还保护上述合成融合基因的方法在基因定量分析中融合基因的标准品构建中的应用。本专利技术还保护上述合成融合基因的方法在工程抗体尤其是双特异性抗体构建中的应用。本专利技术还保护上述合成融合基因的方法在多个编码序列的融合基因表达载体的构建中的应用。本专利技术还保护上述合成融合基因的方法在编码序列与调控元件的融合基因的构建中的应用。本专利技术还保护上述合成融合基因的方法在较长基因的合成中的应用。本专利技术提供的技术方案，具有如下的有益效果：(1)申请人经过长期的研究发现，目前应用的重叠PCR方法成功率不高的原因是没有针对待拼接片段之间的退火进行优化，在片段之间没有快速、高比率的退火形成之后进行PCR会严重影响全长片段的形成，且目前没有已知的方法针对待拼接片段的分段，优化重叠片段之间的退火来提高重叠PCR反应的效率；本专利技术针对提高重叠片段的退火效率提出了有目的地进行合适长度的分段，设计小片段之间的重叠区来提高退火效率，从而提高重叠PCR的成功率；(2)本专利技术可以避免现有技术选取拼接片段的盲目状况，而是精确选取最佳的分段，因而对于后期的重叠PCR的扩增成功率具有突破性的提高，现有的重叠PCR的一次成功率大致在70％～80％左右，而采用本专利技术提供的方法成功率能高达100％；且由于一次成功率的大大提高，本专利技术免去了需要多次尝试PCR条件、改变反应体系中离子强度和添加剂、反应温度等繁琐的优化步骤，大大降低了试剂与人力成本。本专利技术的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本专利技术的实践了解到。具体实施方式下面将结合本专利技术实施例，对本专利技术的技术方案进行清楚、完整地描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本专利技术的技术方案，因此只是作为示例，而不能以此来限制本专利技术的保护范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，数据为三次重复实验的平均值或平均值±标准差。实施例本实施例以合成基因水稻的MTP2基因为例，来进一步说明本专利技术提供的合成融合基因的方法。水稻的MTP2基因序列为(SEQIDNO：1)：ATGGGCTTCCGCCTCGCCCACCTCGCCGCCTGCGTGGCCCGCGCCGCGGCCTCCTCCTCCCGCCTCCGGGGGCCACGCCCCGCCGCCTCCGCGCTCGTCGCCCCTCTCCTCGCCTCGCCGTGGGAGCCGAGCGGCGGCGGCCAGCCGCACTGGCTCGTCCCCTCCCGCGGCCACGTGGGCCACTCCCACCACCACCACCACGGCGAGGAGGTGGGGGGCGAGGCGTCGGAGAGGATCTTCCGGCTGGGGCTCGCGGCCGACGTCGTCCTCACCGTCGGGAAGGCCGTCACCGGCTACCTCTCCGGCAGCACCGCGATCGCCGCCGACGCCGCTCACTCCCTCTCCGACATTGTGCTGAGCGGGGTGGCTCTGCTGTCGTACAAGGCGGCCAAGGCTCCCAGAGACAAGGAGCATCCGTATGGTCATGGAAAGTTTGAGAGTTTAGGAGCTCTTGGAATTTCAA本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种合成融合基因的方法，其特征在于，包括如下步骤：S1：分析待合成融合的基因序列，确定适合进行退火的区域；S2：在所述适合进行退火的区域中选择合适长度的片段，进行各个片段的引物的设计与合成；S3：混合合成的各个片段的引物，然后进行重叠PCR，将各个片段的引物拼接成，得到拼接产物。

【技术特征摘要】
1.一种合成融合基因的方法，其特征在于，包括如下步骤：S1：分析待合成融合的基因序列，确定适合进行退火的区域；S2：在所述适合进行退火的区域中选择合适长度的片段，进行各个片段的引物的设计与合成；S3：混合合成的各个片段的引物，然后进行重叠PCR，将各个片段的引物拼接成，得到拼接产物。2.根据权利要求1所述的合成融合基因的方法，其特征在于：所述S1中，所述确定适合进行退火的区域是根据退火温度确定，所述退火温度为55℃～60℃。3.根据权利要求1所述的合成融合基因的方法，其特征在于：所述S1中，所述确定适合进行退火的区域是根据Primer3、Oligo或DNAStar工具进行确定。4.根据权利要求1所述的合成融合基因的方法，其特征在于：所述S2中，所述合适长度为200～800bp，且保证各片段之间的重叠区域为所述适合进...

【专利技术属性】
技术研发人员：谢昌平，
申请(专利权)人：上海恩即斯生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31