一种改良CTAB抽提红景天RNA的方法技术

本发明专利技术公开了一种改良CTAB抽提红景天RNA的方法，具体步骤为：取新鲜或者‑80℃冷藏的红景天组织，加入液氮，研磨成粉；加入CTAB提取液，混匀，65℃裂解；得到苯酚、氯仿和异戊醇的混合液，加入等体积的苯酚、氯仿和异戊醇的混合液，涡旋振荡15～30sec，4℃下10,000g离心10min，取上清700ul移入新的1.5ml离心管，再加入等体积的氯仿与异戊醇的混合液，涡旋振荡15～30sec，4℃下10,000g离心10min；取上清1ml移入新的1.5ml离心管，加1/3体积8.0M Licl,颠倒混匀，‑20℃过夜；4℃下10,000g离心30min，弃去上清；采用1ml 70％乙醇洗涤沉淀2‑3次，4℃下10,000g离心10min，弃去上清，然后于室温放置5‑10分钟使其晾干；加入15ul的无核酸酶水溶解即可。本发明专利技术具有提取方便、高效、质量好等优点。

An improved method for RNA extraction of Rhodiola rosea CTAB

The invention discloses a method for improved CTAB extraction of Rhodiola RNA, which comprises the following steps: taking fresh or frozen 80 DEG C with liquid nitrogen, plant tissue, grinding into powder; adding CTAB extract, mixing, 65 DEG C cracking; obtain a mixed solution of phenol, chloroform and isoamyl alcohol, adding volume. Phenol, chloroform and isoamyl alcohol mixture, vortex oscillation of 15 ~ 30sec, 4 DEG 10000g centrifugal 10min, the supernatant 700ul into the new 1.5ml centrifuge tube, then add an equal volume of chloroform and isoamyl alcohol mixture, vortex oscillation of 15 ~ 30sec, 4 C 10000g 10min centrifugal supernatant; 1ml in the new 1.5ml centrifuge tube, 1/3 volume 8.0M Licl, reversed mixing, overnight 20 DEG C; 4 DEG 10000g centrifugal 30min, discard the supernatant; using 1ml 70% ethanol precipitation of 2 3 times, 4 DEG 10000g centrifugal 10min, discard the supernatant, however At the room temperature after 5 10 minutes to make it dry; no nuclease water can be dissolved into 15ul. The invention has the advantages of convenient extraction, high efficiency and good quality.

【技术实现步骤摘要】
一种改良CTAB抽提红景天RNA的方法
本专利技术涉及植物RNA制备
，具体来说是一种改良CTAB抽提红景天RNA的方法。
技术介绍
核酸是构成生命体中基本遗传物质的主要化合物，从核酸分子水平系统深入的研究是认识各种生命现象的基础。而高质量的RNA的获得对于功能基因组学以及遗传学研究具有重要意义。目前对动物、植物和微生物RNA提取的方法很多。其中有关植物RNA的抽提方法较多，但由于物种间的差异，RNA提取方法各有不同，现有的方法主要有硫氰酸胍-酚-氯仿抽提和纯化法、酚-SDS法、和CTAB法等几种，其中CTAB法在多种动、植物中抽提RNA上具有广泛的应用，是一种有效、经济抽提RNA的方法。高山红景天(RhodiolasachalinensisA.Bor)别名:蔷薇红景天，扫罗玛布尔(藏名)等；又名库页红景天，是景天科(Crassulaceae)红景天属(RhodiolaroseaL.)植物，为多年生草本或亚灌木,常具肉质匍匐根状茎，是长白山珍稀药用植物之一。生长在海拔1800-2500米高寒无污染地带，其生长环境恶劣，因而具有很强的生命力和特殊的适应性。红景天的主要成分有红景天苷、酪醇及配糖体，除此之外还有淀粉、蛋白质、脂肪、糖类、黄酮类化合物、氨基酸、无机元素、微量精油等。现代药理学研究结果表明红景天具有明显的抗缺氧、抗寒冷、抗疲劳、抗辐射、抗病毒、延缓机体衰老等功效，对于航天、深海、沙漠、高原、体育等行业是一种极具开发应用前景的环境适应药物，同时对高辐射从业人员、微机使用频繁人员、强脑力劳动者、中老年人群具有积极的滋补保健作用亦有很大的美容效果，可作护肤品，也可食用。由于红景天生长环境的特殊，造就了红景天拥有独特的药理和保健作用。近年来有国内外对红景天及其制品的需求呈快速增长的趋势，但是一直以来基本上都是以野生红景天为资源在进行开发和利用，为避免红景天属植物生物资源的减少和生物遗传多样性的丧失，有关红景天生物大分子(例如DNA、RNA和蛋白质等)的分离纯化受到分子生物学
科技人员的重视，但是目前针对景天科植物的RNA提取研究十分缺乏，研究出一种针对景天科植物的RNA提取已成为当前重要的课题之一。
技术实现思路
本专利技术的目的是为了解决现有技术中的无法高效提取红景天RNA的缺陷，提供一种改良CTAB抽提红景天RNA的方法来解决上述问题。本专利技术公开了一种改良CTAB抽提红景天RNA的方法，具体步骤为：(1)、取1-5g新鲜或者-80℃冷藏的红景天组织，加入液氮，研磨成粉，并迅速转移至预冷的2.0ml离心管中；(2)、加入900ulCTAB提取液，混匀，65℃裂解10min，裂解时每管不多于0.2g，期间轻柔颠倒混匀2-3次；(3)、将苯酚、氯仿和异戊醇混合在一起，得到苯酚、氯仿和异戊醇的混合液，向步骤(1)中制备得到的产品中加入等体积的苯酚、氯仿和异戊醇的混合液，涡旋振荡15～30sec，4℃下10,000g离心10min，取上清700ul移入新的1.5ml离心管，再加入等体积的氯仿与异戊醇的混合液，涡旋振荡15～30sec，4℃下10,000g离心10min；(4)、取上清1ml移入新的1.5ml离心管，加1/3体积8.0MLicl,颠倒混匀，-20℃过夜；(5)、4℃下10,000g离心30min，弃去上清；(6)、采用1ml70％乙醇洗涤沉淀2-3次，4℃下10,000g离心10min，弃去上清，然后于室温放置5-10分钟使其晾干；(7)、加入15ul的无核酸酶水溶解即可。作为优选，所述的步骤(1)中，将红景天组织在研鉢中研磨成粉。作为优选，所述的步骤(2)中，在加入CTAB提取液之前，先将CTAB提取液预热至65℃，并且加入质量浓度为5％的巯基乙醇。作为优选，所述的步骤(2)中，所述的CTAB提取液有以下组分配置而成：2％CTAB、2％PVP、100MmTris-HCl、25MmEDTA、2MNaCl。作为优选，所述的Tris-HCl的Ph为8.0，所述的EDTA的Ph为8.0。作为优选，所述的步骤(3)中，所述的苯酚、氯仿和异戊醇的混合液中，按照体积比，苯酚：氯仿：异戊醇为25:24:1，所述的氯仿与异戊醇的混合液，中，按照体积比，氯仿：异戊醇为24:1。作为优选，所述的步骤(6)中，洗涤沉淀之前，需要先对乙醇进行预冷，所述的70％的乙醇是由7份的无水乙醇和3份的水混合而成，所述的水为用0.1％的DEPC处理并经高压灭菌的纯水；作为优选，所述的步骤(9)中，在将无核酸酶水加入吸附膜中间部位时，需要先将无核酸酶水预热至65℃。本专利技术相比现有技术具有以下优点：本专利技术对传统的CTAB法抽提RNA作了许多改进工作：在RNA抽提缓冲液中加入了2％PVP，并可根据材料中多酚和多糖的含量适当调整其用量，并且还利用了β-巯基乙醇有效防止了多酚的氧化；与传统的CTAB不同，本专利技术创新之处在于先用氯仿抽提，加入PVP去除多酚类物质，最后用Licl过夜沉淀，有效减少了多糖的共沉淀，提高了RNA的质量；本专利技术对于红景天的不同组织都适用，已经利用本专利技术从红景天的叶片(例如子叶，真叶)，茎等不同组织中成功抽提出高质量的RNA；本专利技术经济，高效，本专利技术所使用的药品大都为普通的生化试剂，价格低廉，没有利用试剂盒或昂贵的药品。从时间上来看，虽然有过夜沉淀，但是可以获得较高质量的RNA，同时可以多管同时进行操作，获得大量的高质量RNA。附图说明图1红景天叶片抽提的总RNA在琼脂糖胶上的电泳(1XTAE，1％)；图2为红景天茎抽提的总RNA在变琼脂糖胶上的电泳(1xTAE，1％)；图3为红景天叶2RNA2100图；图4为红景天茎2RNA2100图。具体实施方式下面对本专利技术的实施例作详细说明，本实施例在以本专利技术技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本专利技术的保护范围不限于下述的实施例。本专利技术公开了一种改良CTAB抽提红景天RNA的方法，具体步骤为：(1)、取1-5g新鲜或者-80℃冷藏的红景天组织，加入液氮，研磨成粉，并迅速转移至预冷的2.0ml离心管中；(2)、加入900ulCTAB提取液，混匀，65℃裂解10min，裂解时每管不多于0.2g，期间轻柔颠倒混匀2-3次；(3)、将苯酚、氯仿和异戊醇混合在一起，得到苯酚、氯仿和异戊醇的混合液，向步骤(1)中制备得到的产品中加入等体积的苯酚、氯仿和异戊醇的混合液，涡旋振荡15～30sec，4℃下10,000g离心10min，取上清700ul移入新的1.5ml离心管，再加入等体积的氯仿与异戊醇的混合液，涡旋振荡15～30sec，4℃下10,000g离心10min；(4)、取上清1ml移入新的1.5ml离心管，加1/3体积8.0MLicl,颠倒混匀，-20℃过夜；(5)、4℃下10,000g离心30min，弃去上清；(6)、采用1ml70％乙醇洗涤沉淀2-3次，4℃下10,000g离心10min，弃去上清，然后于室温放置5-10分钟使其晾干；(7)、加入15ul的无核酸酶水溶解即可。作为优选，所述的步骤(1)中，将红景天组织在研鉢中研磨成粉。作为优选，所述的步骤(2)中，在加入CTAB提取液之前，先将CTAB提取液预热至65℃，并且加入质量浓度为本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种改良CTAB抽提红景天RNA的方法，其特征在于：具体步骤为：(1)、取1‑5g新鲜或者‑80℃冷藏的红景天组织，加入液氮，研磨成粉，并迅速转移至预冷的2.0ml离心管中；(2)、加入900ul CTAB提取液，混匀，65℃裂解10min，裂解时每管不多于0.2g，期间轻柔颠倒混匀2‑3次；(3)、将苯酚、氯仿和异戊醇混合在一起，得到苯酚、氯仿和异戊醇的混合液，向步骤(1)中制备得到的产品中加入等体积的苯酚、氯仿和异戊醇的混合液，涡旋振荡15～30sec，4℃下10,000g离心10min，取上清700ul移入新的1.5ml离心管，再加入等体积的氯仿与异戊醇的混合液，涡旋振荡15～30sec，4℃下10,000g离心10min；(4)、取上清1ml移入新的1.5ml离心管，加1/3体积8.0M Licl,颠倒混匀，‑20℃过夜；(5)、4℃下10,000g离心30min，弃去上清；(6)、采用1ml 70％乙醇洗涤沉淀2‑3次，4℃下10,000g离心10min，弃去上清，然后于室温放置5‑10分钟使其晾干；(7)、加入15ul的无核酸酶水溶解即可。

【技术特征摘要】
1.一种改良CTAB抽提红景天RNA的方法，其特征在于：具体步骤为：(1)、取1-5g新鲜或者-80℃冷藏的红景天组织，加入液氮，研磨成粉，并迅速转移至预冷的2.0ml离心管中；(2)、加入900ulCTAB提取液，混匀，65℃裂解10min，裂解时每管不多于0.2g，期间轻柔颠倒混匀2-3次；(3)、将苯酚、氯仿和异戊醇混合在一起，得到苯酚、氯仿和异戊醇的混合液，向步骤(1)中制备得到的产品中加入等体积的苯酚、氯仿和异戊醇的混合液，涡旋振荡15～30sec，4℃下10,000g离心10min，取上清700ul移入新的1.5ml离心管，再加入等体积的氯仿与异戊醇的混合液，涡旋振荡15～30sec，4℃下10,000g离心10min；(4)、取上清1ml移入新的1.5ml离心管，加1/3体积8.0MLicl,颠倒混匀，-20℃过夜；(5)、4℃下10,000g离心30min，弃去上清；(6)、采用1ml70％乙醇洗涤沉淀2-3次，4℃下10,000g离心10min，弃去上清，然后于室温放置5-10分钟使其晾干；(7)、加入15ul的无核酸酶水溶解即可。2.根据权利要求1所述的一种改良CTAB抽提红景天RNA的方法，其特征在于：所述的步骤(1)中，将红景天组织在研鉢中研磨成粉。3.根据权利要求1所述的一种改良CTAB抽提红景天RNA的方...

【专利技术属性】
技术研发人员：韦玉军，李航，王文娟，苏军，吴远航，
申请(专利权)人：安徽安龙基因医学检验所有限公司，
类型：发明
国别省市：安徽,34