从鱼类的精液分离多脱氧核糖核苷酸的方法、由所述方法获得的多脱氧核糖核苷酸及其用途技术

本发明专利技术涉及一种从鱼类的精液分离PDRN的方法，包括：(1)将鱼类的精液进行第1次离心分离，获取包含精液细胞的沉淀物的步骤；(2)将所述沉淀物添加于细胞溶解缓冲液，制造细胞溶解物后，使所述细胞溶解物消化的步骤；(3)将经过所述(2)步骤的细胞溶解物进行第2次离心分离，获取上清液的步骤；(4)在根据所述(3)步骤而获取的上清液中投入饱和氯化钠水溶液并混合后，进行第3次离心分离，获取包含DNA的上清液的步骤；(5)在根据所述(4)步骤而获取的上清液中投入乙醇并使DNA沉淀后，收集所述沉淀的DNA并进行干燥的步骤；及(6)用物理方法破碎根据所述(5)步骤而获得的DNA，获取多脱氧核糖核苷酸的步骤。

Method for separating multiple nucleotides from fish semen, multiple nucleotides obtained by the method and their uses

The invention relates to a method for separating PDRN from the semen of fish, including: (1) the fish semen was first times of centrifugation, contains sperm cells precipitate steps; (2) the precipitate is added to the lysis buffer, manufacturing cell lysate, the cell lysate digestion steps; (3) after the (2) cell lysis step second times centrifugation, supernatant obtained in steps; (4) according to the (3) step and access into the supernatant of saturated sodium chloride aqueous solution and mixed after third times of centrifugation, supernatant obtained contains DNA steps; (5) according to the (4) step and access into the supernatant and the DNA ethanol precipitation, drying steps to collect the precipitate and DNA; and (6) physical crushing method according to the steps of (5) obtained by D NA, the steps to obtain multiple nucleotides.

【技术实现步骤摘要】
从鱼类的精液分离多脱氧核糖核苷酸的方法、由所述方法获得的多脱氧核糖核苷酸及其用途
本专利技术涉及一种从鱼类的精液分离多脱氧核糖核苷酸(polydeoxyribonucleotide；PDRN)的方法、根据所述方法而获得的PDRN及其用途。
技术介绍
PDRN作为存在于生物体内的组织再生活性物质，由50个至2000个之间的碱基对结合成链状的脱氧核苷酸聚合物(deoxyribonucleotidespolymers)的混合物构成。所述PDRN在欧洲等地被许可为医药品，用于伤口治愈及美容。具体而言，当将所述PDRN应用于临床时，表现出伤口治疗时间缩短和正常组织化作用以及糖尿病性足部溃疡的迅速伤口闭合作用，已知对痤疮及褥疮、伤口治愈、疤痕疾病、细丝纹、皮肤老化、日晒老化、改善皮肤弹力、整形手术后快速治愈、脱发、改善血液循环等有效。另外，所述PDRN具有亲水性特性，不引起过敏反应或体内排异反应，由于抗热性，不因高温灭菌而破坏，保持活性，因而非常容易应用于再生医学领域中使用的医药品领域及化妆品领域等多样的产业领域。作为利用所述PDRN的以往技术，专利文献1(韩国公开专利公报第10-2014-0030605号)对将PDRN与牙齿一同构成从而提高牙槽骨再生速度的牙槽骨再生用试剂盒(kit)进行了记载，专利文献2(韩国公开专利公报第10-2015-0068647号)对含有微粒化PDRN的滴眼剂组合物进行了记载，专利文献3(韩国注册专利公报第10-1590498号)对包含芦荟提取物及PDRN的化妆品组合物进行了记载。以往，PDRN主要是通过降低从鲑鱼或鳟鱼的精巢或精液分离的DNA的分子量的过程而制造的，这种用于获得PDRN的DNA分离法是基于曾应用于哺乳类等其它物种的技术发展而来的。具体而言，以往作为从鱼类的组织分离DNA的方法，一般使用包含使用苯酚和三氯甲烷的过程的DNA分离方法。例如，在非专利文献1(Taggart,J.B,.etal.,J.FishBiol.1992,40,963-65.)中，记载了使用苯酚/三氯甲烷/异戊醇(phenol/chloroform/isoamylalcohol)从鲑鱼科鱼类的骨骼肌、肝脏、鳍组织提取DNA的方法。但是，所述方法存在如下问题：即，为了回收DNA，不仅需要过多的步骤和时间，而且存在使用有害于人体的苯酚和三氯甲烷。另外，所述方法需要使用昂贵的化学物质或器具，因而在大量生产体制下，在费用方面存在不够有效的问题。作为解决这种问题的以往方法，专利文献4(韩国公开专利公报第10-2009-0079413号)记载有，在通过酶分解、灭菌及分子量降低工序而制造特定分子量范围的DNA聚合物片断方面，在中性的pH下执行酶分解工序，从而以更环保、安全的方法获得DNA聚合物片断复合体。但是，即便是专利文献4，其在分子量降低工序时，为了匹配pH而使用盐酸和醋酸，因而不能说是100％安全、环保的方法，另外，在获得令人满意的高纯度DNA聚合物片断复合体方面也存在局限。【现有技术文献】【专利文献】(专利文献1)KR1020140030605A(专利文献2)KR1020150068647A(专利文献3)KR101590498B(专利文献4)KR1020090079413A【非专利文献】(非专利文献1)TaggartJ.B.etal.,J.FishBiol.1992,40,963-965.
技术实现思路
技术问题本专利技术要提供一种从鱼类的精液分离PDRN的方法，本专利技术使用蛋白质分解酶及饱和氯化钠代替诸如苯酚或三氯甲烷的有机溶剂来分离DNA，作为所述DNA的破碎方法，利用诸如超声波分解法等的物理方法，从而以高效、低费用且无毒性的安全的方法，从鱼类的精液分离PDRN。另外，本专利技术想要提供一种根据所述方法而获得的高纯度的PDRN及利用其制造的医药品及化妆品。解决问题的方案为了解决如上所述的课题，本专利技术提供一种从鱼类的精液分离PDRN的方法，包括：(1)将鱼类的精液进行第1次离心分离，获取包含精液细胞的沉淀物的步骤；(2)将所述沉淀物添加于细胞溶解缓冲液，制造细胞溶解物后，使所述细胞溶解物消化的步骤；(3)将经过所述(2)步骤的细胞溶解物进行第2次离心分离，获取上清液的步骤；(4)在根据所述(3)步骤而获取的上清液中投入饱和氯化钠水溶液并混合后，进行第3次离心分离，获取包含DNA的上清液的步骤；(5)在根据所述(4)步骤而获取的上清液中投入乙醇并使DNA沉淀后，收集所述沉淀的DNA并进行干燥的步骤；及(6)将根据所述(5)步骤而获得的DNA用物理方法破碎，获取多脱氧核糖核苷酸(polydeoxyribonucleotide；PDRN)的步骤。所述鱼类可以为鲑鱼科鱼类，优选地可以为虹鳟鱼。在所述(2)步骤中，所述细胞溶解缓冲液可以包括选自由Tris-HCl(三(羟甲基)氨基甲烷，tris-(hydroxymethyl)-aminomethane-HCl)、NaCl及Na2EDTA(乙二胺四乙酸二钠，ethylenediaminetetraaceticaciddisodiumsalt)组成的组中的某一种或两种以上。而且，在所述(2)步骤中，所述细胞溶解物的消化可以使用十二烷基硫酸钠溶液、Na2EDTA溶液及蛋白水解酶K溶液的混合溶液来执行，可以在30～39℃下执行12～20小时。在所述(4)步骤中，所述上清液与所述饱和氯化钠水溶液的投入比率可以为2:1至1:2的重量比。借助于分光光度计测量的根据所述(5)步骤而获取的DNA的纯度(260nm/280nm)可以为1.8～2.2。可以还包括：将根据所述(5)步骤而获得的干燥DNA溶解于去离子水后，进行冻结干燥的步骤。在所述(6)步骤中，所述物理方法可以为超声波分解法。优选地，所述(6)步骤可以包括：(i)将根据所述(5)步骤而获得的DNA溶解于选自由脱盐水、食盐水(0.9％NaCl)及磷酸盐缓冲食盐水组成的组中的某一种或两种以上的混合溶液，制造DNA溶液的步骤；及(ii)将所述DNA溶液进行超声波分解的步骤，此时的所述DNA溶液的浓度可以为2～10mg/mL。在所述(6)步骤中，优选地，根据所述(i)步骤而制造的DNA溶液是在1～5℃下培养2～4小时后，进入所述(ii)步骤；所述超声波分解在以所述DNA溶液的浓度10mg/mL为基准时，可以在1～5℃下执行5～30分钟。另外，本专利技术的从鱼类的精液分离PDRN的方法可以还包括：将根据所述(6)步骤而获得的PDRN通过精密过滤膜进行过滤的步骤；将通过所述过滤膜的PDRN进行冻结干燥的步骤；及将所述冻结干燥的PDRN溶解于食盐水的步骤。另一方面，本专利技术提供一种根据所述方法从鱼类的精液分离的PDRN及利用所述PDRN而制造的医药品或化妆品。有益效果根据本专利技术，在从鱼类的精液分离DNA的过程中，代替诸如苯酚或三氯甲烷的有机溶剂，而使用蛋白质分解酶及饱和氯化钠，将获取的DNA用诸如超声波分解法等物理方法破碎并进行低分子量化，从而能够以高效、低费用且无毒性的100％安全、环保的方法来提供PDRN。另外，根据本专利技术，能够提供高纯度的PDRN，所述PDRN能够用于医药品及化妆品等多样的用途。附图说明图1比较图示了根据实施例准备的虹鳟鱼的精液本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种从鱼类的精液分离PDRN的方法，其特征在于，包括：(1)将鱼类的精液进行第1次离心分离，获取包含精液细胞的沉淀物的步骤；(2)将所述沉淀物添加于细胞溶解缓冲液，制造细胞溶解物后，使所述细胞溶解物消化的步骤；(3)将经过所述(2)步骤的细胞溶解物进行第2次离心分离，获取上清液的步骤；(4)在根据所述(3)步骤而获取的上清液中投入饱和氯化钠水溶液并混合后，进行第3次离心分离，获取包含DNA的上清液的步骤；(5)在根据所述(4)步骤而获取的上清液中投入乙醇并使DNA沉淀后，收集所述沉淀的DNA并进行干燥的步骤；及(6)用物理方法破碎根据所述(5)步骤而获得的DNA，获取PDRN的步骤。

【技术特征摘要】
2016.04.05 KR 10-2016-00416151.一种从鱼类的精液分离PDRN的方法，其特征在于，包括：(1)将鱼类的精液进行第1次离心分离，获取包含精液细胞的沉淀物的步骤；(2)将所述沉淀物添加于细胞溶解缓冲液，制造细胞溶解物后，使所述细胞溶解物消化的步骤；(3)将经过所述(2)步骤的细胞溶解物进行第2次离心分离，获取上清液的步骤；(4)在根据所述(3)步骤而获取的上清液中投入饱和氯化钠水溶液并混合后，进行第3次离心分离，获取包含DNA的上清液的步骤；(5)在根据所述(4)步骤而获取的上清液中投入乙醇并使DNA沉淀后，收集所述沉淀的DNA并进行干燥的步骤；及(6)用物理方法破碎根据所述(5)步骤而获得的DNA，获取PDRN的步骤。2.根据权利要求1所述的从鱼类的精液分离PDRN的方法，其特征在于，所述鱼类为鲑鱼科鱼类。3.根据权利要求1所述的从鱼类的精液分离PDRN的方法，其特征在于，所述鱼类为虹鳟鱼。4.根据权利要求1所述的从鱼类的精液分离PDRN的方法，其特征在于，在所述(2)步骤中，所述细胞溶解缓冲液包括选自由Tris-HCl、NaCl及Na2EDTA组成的组中的某一种或两种以上。5.根据权利要求1所述的从鱼类的精液分离PDRN的方法，其特征在于，在所述(2)步骤中，所述细胞溶解物的消化使用十二烷基硫酸钠溶液、Na2EDTA溶液及蛋白水解酶K溶液的混合溶液来执行。6.根据权利要求1所述的从鱼类的精液分离PDRN的方法，其特征在于，在所述(2)步骤中，所述细胞溶解物的消化在30～39℃下执行12～20小时。7.根据权利要求1所述的从鱼类的精液分离PDRN的方法，其特征在于，在所述(4)步骤中，所述上清液与所述饱和氯化钠水溶液的投入比率为2:1至1:2的重量比...

【专利技术属性】
技术研发人员：金德圭，
申请(专利权)人：达特珂贝怡股份有限公司，
类型：发明
国别省市：韩国,KR