The invention describes by Sanger sequencing (Sanger Sequencing) for next generation sequencing (Next Generation Sequencing; NGS) results re sequencing, determination method, compositions and kits or inspection. These methods are particularly applicable to samples with extremely limited amounts, such as Ma Lin (formalin) fixation, paraffin embedded (FFPE), laser capture microdissection (LCM), fine needle biopsy or extraction.
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】基因序列校验组合物、方法和试剂盒
交叉参考:本申请案要求2014年10月3日申请的美国临时申请案第62/059,821号和2014年10月3日申请的第62/059,824号在35U.S.C§119(e)下的优先权,其公开内容以全文引用的方式并入本文中以用于所有目的。在本申请中,引用各种公开案、专利案和/或专利申请案。所述公开案、专利案和/或专利申请案的公开内容在此以全文引用的方式并入本申请案中以便更充分地描述本专利技术所涉及的目前最先进的水平。本传授内容涉及经化学修饰的寡核苷酸序列引物组合物以及用于DNA测序和片段分析的方法。教示内容还涉及用于制备、片段分析和核酸(如cDNA和DNA)测序的组合物。具体来说,描述用于扩增含有多个目标序列的样品内的一个或多个目标序列的方法、组合物、系统、设备和试剂盒。任选地,在单次扩增反应内扩增多个目标序列,例如至少10、50、100、500或1000个。在一些实施例中,本专利技术大体上涉及用于扩增来自单一来源(如基因组DNA或福马林固定的链烷烃嵌入(FFPE)型DNA)的一个或多个目标序列的方法、组合物、系统、设备和试剂盒。本专利技术中描述扩增和测序的方法以及其组合物和试剂盒,其可用于通过桑格测序(Sangersequencing)(与通过NGS方法进行的测序组合/依序进行或在其之后进行)来验证来自单一来源的一个或多个目标序列的核苷酸序列。
技术实现思路
在本专利技术的一个方面中,提供用于测序至少一个扩增子的方法,其包括以下步骤:提供至少一个扩增子,其中所述至少一个扩增子包含相关序列和从第一激活序列并入的相对于相关序列位于 ...
【技术保护点】
一种用于对至少一个扩增子进行测序的方法,其包含以下步骤:a)提供至少一个扩增子,其中所述至少一个扩增子包含相关序列和相对于从第一激活序列并入的相关序列位于5′的前导序列;b)在包含多个核酸酶敏感性扩增引物的第一反应混合物中使所述至少一个扩增子扩增以形成经扩增的DNA产物;c)使所述含有所述经扩增的DNA产物的第一反应混合物与包含核酸酶和至少一个化学增强型引物的第二反应混合物接触,从而使所述多个核酸酶敏感性扩增引物由所述核酸酶降解;d)使所述核酸酶失活;e)在测序反应中用至少一个化学增强型引物激活所述经扩增的DNA产物;以及f)制备所述至少一个化学增强型引物的延伸产物。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.10.03 US 62/059821;2014.10.03 US 62/0598241.一种用于对至少一个扩增子进行测序的方法,其包含以下步骤:a)提供至少一个扩增子,其中所述至少一个扩增子包含相关序列和相对于从第一激活序列并入的相关序列位于5′的前导序列;b)在包含多个核酸酶敏感性扩增引物的第一反应混合物中使所述至少一个扩增子扩增以形成经扩增的DNA产物;c)使所述含有所述经扩增的DNA产物的第一反应混合物与包含核酸酶和至少一个化学增强型引物的第二反应混合物接触,从而使所述多个核酸酶敏感性扩增引物由所述核酸酶降解;d)使所述核酸酶失活;e)在测序反应中用至少一个化学增强型引物激活所述经扩增的DNA产物;以及f)制备所述至少一个化学增强型引物的延伸产物。2.根据权利要求1所述的方法,其中所述延伸产物经荧光标记。3.根据前述权利要求中任一权利要求所述的方法,其中使用所述第一激活序列产生所述扩增子。4.根据前述权利要求中任一权利要求所述的方法,其中所述第一激活序列包含至少一个可裂解部分。5.根据权利要求4所述的方法,其中所述前导序列是所述第一激活序列的一部分。6.根据前述权利要求中任一权利要求所述的方法,其中所述使所述第一反应混合物与所述第二反应混合物接触、使所述核酸酶失活以及制备所述化学增强型引物的延伸产物的步骤是在同一个反应容器中进行。7.根据前述权利要求中任一权利要求所述的方法,其中所述使所述至少一个扩增子扩增、使所述第一反应混合物与所述第二反应混合物接触、使所述核酸酶失活以及制备所述化学增强型引物的延伸产物的步骤是在不存在中间纯化步骤的情况下进行。8.根据前述权利要求中任一权利要求所述的方法,其中所述至少一个扩增子进一步包含相对于所述相关序列位于3′的接续序列,其中所述接续序列与用于产生所述至少一个扩增子的第二激活序列互补。9.根据前述权利要求中任一权利要求所述的方法,其中所述至少一个扩增子具有约100个核苷酸到约400个核苷酸的长度。10.根据前述权利要求中任一权利要求所述的方法,其中所述相关序列具有约100个核苷酸到约300个核苷酸的长度。11.根据前述权利要求中任一权利要求所述的方法,其中所述至少一个扩增子是多个扩增子。12.根据权利要求11所述的方法,其中所述多个扩增子包含至少两个不同扩增子,第一个具有包含主要变异序列的相关序列并且第二个包含来自样品核酸的相同区域的次要变异序列。13.根据前述权利要求中任一权利要求所述的方法,其进一步包含:a)基于所述测序反应获得测序结果;以及b)基于所述结果测定至少所述相关序列的核苷酸碱基序列。14.根据权利要求13所述的方法,其中所述测序结果是通过基于迁移率的分离方法获得。15.根据权利要求14所述的方法,其中所述基于迁移率的分离方法是毛细电泳。16.根据权利要求13所述的方法,其中比较所测定的至少所述相关序列的核苷酸碱基序列与从NGS测序方法获得的至少所述相关序列的第二核苷酸碱基序列。17.根据权利要求16所述的方法,其中所述NGS测序方法是半导体测序。18.根据前述权利要求中任一权利要求所述的方法,其中所述第二反应混合物进一步包含聚合酶、脱氧核苷酸三磷酸酯和经染料标记的双脱氧核苷酸三磷酸酯。19.根据前述权利要求中任一权利要求所述的方法,其中扩增DNA包含聚合酶链反应扩增。20.根据前述权利要求中任一权利要求所述的方法,其中所述第一反应混合物进一步包含聚合酶。21.根据权利要求20所述的方法,其中所述聚合酶是热稳定聚合酶。22.根据权利要求20到21中任一权利要求所述的方法,其中所述聚合酶是Taq聚合酶。23.根据前述权利要求中任一权利要求所述的方法,其中所述第二反应混合物的聚合酶是热稳定聚合酶。24.根据权利要求23所述的方法,其中所述聚合酶是Taq聚合酶。25.根据前述权利要求中任一权利要求所述的方法,其中所述核酸酶选自外切核酸酶I、ExoIII、Pfu和DNApolI。26.根据前述权利要求中任一权利要求所述的方法,其中所述化学增强型引物包含寡核苷酸序列、NCM和没有或至少一个核酸酶抗性键。27.根据前述权利要求中任一权利要求所述的方法,其中所述化学增强型引物包含末端3′端处的一个核酸酶抗性键。28.根据前述权利要求中任一权利要求所述的方法,其中所述测序反应包含循环测序。29.根据前述权利要求中任一权利要求所述的方法,其中所述化学增强型引物包含末端5′端处或所述化学增强型引物的寡核苷酸序列内的多个NCM。30.根据前述权利要求中任一权利要求所述的方法,其中所述NCM是(Cn)间隔基,其中n是1到9的任何整数。31.根据权利要求30所述的方法,其中所述NCM包含多个(Cn)间隔基。32.根据前述权利要求中任一权利要求所述的方法,其中所述化学增强型引物具有下式的结构:(Cn)x-OLIGO,其中(Cn)x具有下式的结构:其中n的每个实例独立地是1到9的整数;并且x是1到约30的整数;OLIGO具有下式的结构:其中B是核碱基;K是S或O;m是0或1;z是3到约100的整数;W是OH、F、OMe或H;并且Nt是具有下式的部分:33.根据前述权利要求中任一权利要求所述的方法,其中所述多个核酸酶敏感性扩增引物中的每一个经配置以激活特定疾病病况的相关序列。34.根据前述权利要求中任一权利要求所述的方法,其中所述多个核酸酶敏感性扩增引物激活与特定疾病病况相关的一组序列。35.一种用于确定DNA序列的方法,其包含以下步骤:a)使用至少第一激活序列扩增包含核酸的样品以提供多个扩增子,其中所述多个扩增子中的每一个包含相关序列和相对于从第一激活序列并入的相关序列位于5′的前导序列;b)在包含多个核酸酶敏感性扩增引物的第一反应混合物中使所述多个扩增子的第一等分试样扩增以形成经扩增的DNA产物;c)使所述含有所述经扩增的DNA产物的第一反应混合物与包含核酸酶和至少一个化学增强型引物的第二反应混合物接触,从而使所述核酸酶敏感性扩增引物由所述核酸酶降解;d)使所述核酸酶失活;e)在测序反应中用所述至少一个化学增强型引物激活所述经扩增的DNA产物;以及f)制备所述化学增强型引物的延伸产物。36.根据权利要求35所述的方法,其中所述延伸产物经荧光标记。37.根据权利要求35到36中任一权利要求所述的方法,其中使用所述第一激活序列产生所述扩增子。38.根据权利要求35到37中任一权利要求所述的方法,其中所述第一激活序列包含至少一个可裂解部分。39.根据权利要求38所述的方法,其中所述使所述第一反应混合物与所述第二反应混合物接触、使所述核酸酶失活以及制备所述化学增强型引物的延伸产物的步骤是在同一个反应容器中进行。40.根据权利要求35到39中任一权利要求所述的方法,其中所述使所述多个扩增子扩增、使所述第一反应混合物与所述第二反应混合物接触、使所述核酸酶失活以及制备所述化学增强型引物的延伸产物的步骤是在不存在中间纯化步骤的情况下进行。41.根据权利要求35到40中任一权利要求所述的方法,其中所述多个扩增子中的每一个进一步包含相对于所述相关序列位于3′的接续序列,其中所述接续序列与用于产生所述至少一个扩增子的第二激活序列互补。42.根据权利要求35到41中任一权利要求所述的方法,其中所述多个扩增子包含至少两个不同扩增子,第一个具有包含主要变异序列的相关序列并且第二个包含来自样品核酸的相同区域的次要变异序列。43.根据权利要求35到42中任一权利要求所述的方法,其中所述多个扩增子中的每一个具有约100个核苷酸到约400个核苷酸的长度。44.根据权利要求35到43中任一权利要求所述的方法,其中所述多个扩增子中的每一个的每个相关序列具有约100个核苷酸到约300个核苷酸的长度。45.根据权利要求35到44中任一权利要求所述的方法,其进一步包含:a)基于所述测序反应获得测序结果;以及b)基于所述结果测定至少所述相关序列的核苷酸碱基序列。46.根据权利要求45所述的方法,其中所述测序结果是通过基于迁移率的分离方法获得。47.根据权利要求46所述的方法,其中所述基于迁移率的分离方法是毛细电泳。48.根据权利要求45所述的方法,其中比较至少所述相关序列的所测定的核苷酸碱基序列与从对所述多个扩增子的第二等分试样进行NGS测序方法获得的至少所述相关序列的第二核苷酸碱基序列。49.根据权利要求48所述的方法,其中所述NGS测序方法是半导体测序。50.根据权利要求35到49中任一权利要求所述的方法,其中所述第二反应混合物进一步包含聚合酶、脱氧核苷酸三磷酸酯和经染料标记的双脱氧核苷酸三磷酸酯。51.根据权利要求35到50中任一权利要求所述的方法,其中扩增DNA包含聚合酶链反应扩增。52.根据权利要求35到50中任一权利要求所述的方法,其中所述第一反应混合物进一步包含聚合酶。53.根据权利要求52所述的方法,其中所述聚合酶是热稳定聚合酶。54.根据权利要求52到53中任一权利要求所述的方法,其中所述聚合酶是Taq聚合酶。55.根据权利要求35到55中任一权利要...
【专利技术属性】
技术研发人员:E施雷伯,K瓦马,M安德森,
申请(专利权)人:生命科技公司,
类型:发明
国别省市:美国,US
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