用于抗咪草烟除草剂基因型检测的功能标记AS‑ALS及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一个用于抗咪草烟除草剂基因型检测的功能标记AS‑ALS及其应用。该标记由两个引物组合F1N(AS‑ALS‑F1和AS‑ALSn‑R2‑2)和F1M(AS‑ALS‑F1和AS‑ALSm‑R2‑1)构成，F1N能扩增出条带的样品即为ALS‑G基因型，F1M能扩增出条带的样品即为ALS‑A基因型，F1N和F1M均能扩增出条带的样品即为ALS‑G和ALS‑A的杂合基因型。本发明专利技术公开的标记和方法可以用于品种资源及杂交后代的基因型检测，有利于加快抗除草剂育种进程。该方法准确性高、操作简单、检测效率高、成本低廉，具有很强的实用价值。

For the detection of Imazethapyr herbicide resistant genotype AS functional marker ALS and its application

The invention discloses a for detection of anti imazethapyr herbicide genotype AS functional marker ALS and its application. The mark is composed of two primer combinations of F1N (AS ALS and AS F1 ALSn R2 2) and F1M (AS ALS and AS F1 ALSm R2 1), F1N can amplify bands of the samples is ALS G genotype, F1M can amplify bands of samples is the ALS genotype A, F1N and F1M could amplify bands of samples that were heterozygous genotypes of ALS G and ALS A. The markers and methods disclosed in this paper can be used for genotype detection of germplasm resources and hybrid progenies, and it is beneficial to speed up the breeding process of herbicide resistance. The method has high accuracy, simple operation, high detection efficiency, low cost, and has strong practical value.

【技术实现步骤摘要】
用于抗咪草烟除草剂基因型检测的功能标记AS-ALS及其应用
本专利技术属于农业生物工程领域，涉及用于抗咪草烟除草剂基因型检测的功能标记AS-ALS及其应用。
技术介绍
水稻是全世界近一半人口的主粮，也是我国主要的粮食作物之一。水稻传统的栽培方式以人工栽种为主，费时费力，随着人力成本的提高，水稻栽培成本也大幅提高，效益低下。近年来，随着我国新型城镇化和现代农业的发展，水稻生产正在向集约化、规模化、机械化发展，机插秧、直播等轻简栽培已成为发展趋势。然而，直播稻田容易滋生杂草及杂草稻，严重影响水稻生长、产量及稻谷品质。人工除草的成本极高，制约了水稻生产朝着高产、高效、低成本方向发展，不利于发展现代农业。因此，开展抗除草剂的水稻育种和应用对于水稻优质、高效生产有着重要的意义。咪唑啉酮类除草剂是由美国氰胺公司开发成功的一类高效广谱低毒的除草剂，目前已经有6种商品化，包括：咪唑烟酸、咪唑乙烟酸、咪草酸、咪唑喹啉酸、甲氧咪草烟和甲基咪草烟。其中咪唑乙烟酸，又称为咪草烟，是一种常用于大豆田的高效除草剂，能有效防除一年生禾本科杂草和阔叶杂草(石磊.农药市场信息,2003,7:16.)。咪草烟的作用机理是通过抑制乙酰乳酸合成酶(AcetolactateSynthase，ALS)，从而抑制侧链氨基酸的合成(GastonS,etal.Physiologiaplantarum,2002,114(4):524-532.)。本专利技术人所在团队拟现有水稻品种资源材料中筛选抗咪草烟的水稻材料。找到抗咪草烟的水稻材料ALS基因序列突变位点，开发抗咪草烟的水稻材料ALS基因分子标记。该基因可以通过回交转育到栽培品种中，但传统上需要进行喷施除草剂逐代筛选鉴定，其过程经历多代的杂交和回交，育种周期长，而且该基因为显性基因，表型选择难以剔除杂合基因型，更加大了育种周期和难度。因此，利用分子标记辅助选择(Marker-AssistedSelection,MAS)技术，进行基因型筛选鉴定，加快杂交后代的早代稳定，对于抗除草剂基因快速转育、加快育种进程具有重要意义。本专利技术根据该位点的突变，设计了等位基因特异PCR标记，进行基因型选择，加快早代稳定，建立了抗除草剂分子育种技术体系。
技术实现思路
技术问题本专利技术的目的是针对将抗除草剂基因检测过程繁琐的问题，提供一个用于检测样品中携带抗除草剂或感除草剂基因的分子标记AS-ALS；本专利技术的另一目的是提供了一种AS-ALS标记用于检测水稻品种中含有抗除草剂或感除草剂基因的检测方法；本专利技术的又一目的是提供了一种AS-ALS标记用于检测杂交后代抗除草剂或感除草剂基因的携带情况，利于分子标记辅助选育抗除草剂新品系。技术方案本专利技术提供了一种用于抗咪草烟除草剂基因型检测的功能标记AS-ALS，所述抗咪草烟除草剂基因型为ALS基因编码区第1880位碱基G转换为A的突变，一种能够通过两个PCR检测，明确ALS基因第1880位碱基为G(感咪草烟)，还是为A(抗咪草烟)的鉴定方法，从而能够快速筛选样品中是携带抗咪草烟，还是携带感咪草烟的基因型。本专利技术的准确性高、操作简单、检测效率高、成本低廉，具有很强的实用价值。具体而言，本专利技术根据水稻ALS基因第1880位碱基的功能突变位点，设计的功能标记AS-ALS包含两个引物组合：F1N和F1M；其中所述的F1N引物组合包含上下游两个引物：AS-ALS-F1与AS-ALSn-R2-2，所述的F1M引物组合包含上下游两个引物：AS-ALS-F1与AS-ALSm-R2-1：所述的AS-ALS-F1序列：5’-GAGGCAATCATCGCTACTGG-3’，所述的AS-ALSn-R2-2序列：5’-TGTCCTTGAATGCGCCCCTAC-3’，所述的AS-ALSm-R2-1序列：5’-TGTCCTTGAATGCGCCCCTAT-3’含有感咪草烟ALS-G基因型的样品能被F1N引物组合扩增出547bp条带，含有抗咪草烟ALS-A基因型的样品能被F1M引物组合扩增出547bp条带，同时含有ALS-G和ALS-A基因型的样品能同时被F1N和F1M两种引物组合扩增出547bp条带。利用所述的功能标记AS-ALS检测样品中ALS基因型的方法，其特征在于，含有感咪草烟ALS-G基因型的样品能被F1N引物组合扩增出547bp条带，含有抗咪草烟ALS-A基因型的样品能被F1M引物组合扩增出547bp条带。含有ALS-G和ALS-A基因型的样品能同时被F1N和F1M两种引物组合扩增出547bp条带。利用所述的功能标记AS-ALS检测分别以含有感咪草烟ALS-G基因型的品种和含有抗咪草烟ALS-A基因型的品种配组后代ALS基因型的方法，其特征在于，含有感咪草烟ALS-G基因型的材料能被F1N引物组合扩增出547bp条带，含有抗咪草烟ALS-A基因型的材料能被F1M引物组合扩增出547bp条带，同时含有ALS-G和ALS-A基因型的材料能同时被F1N和F1M两种引物组合扩增出547bp条带。有益效果本专利技术人所在团队利用从7403份水稻品种资源材料中筛选到一个抗咪草烟的水稻材料“金粳818”。通过对“金粳818”的ALS基因序列进行测序分析发现，其ALS基因编码区与其它粳稻品种间存在一个碱基的突变，即”金粳818”ALS基因编码区第1880位碱基由G突变为A。该基因可以通过回交转育到栽培品种中，但传统上需要进行喷施除草剂逐代筛选鉴定，其过程经历多代的杂交和回交，育种周期长，而且该基因为显性基因，表型选择难以剔除杂合基因型，更加大了育种周期和难度。因此，利用MAS技术，进行基因型筛选鉴定，加快杂交后代的早代稳定，对于抗除草剂基因快速转育、加快育种进程具有重要意义。本专利技术根据该位点的突变，设计了等位基因特异PCR标记，进行基因型选择，加快早代稳定，建立了抗除草剂分子育种技术体系。本专利技术所提供的检测抗除草剂或感除草剂基因的功能标记AS-ALS及其应用，具有如下优点：通过本专利技术获得了一个功能标记AS-ALS，该标记不是与ALS基因连锁的标记，而是根据功能突变位点开发而成，鉴定结果能直接反应植株的抗性，不存在遗传交换的风险；对功能标记进行了引物组合的筛选和PCR反应条件的优化，扩增产物准确可靠且效果稳定，无假阳性现象；该功能标记能够快速准确的区分抗除草剂或感除草剂基因(包括籼稻和粳稻)，弥补了喷施农药带来的农药残留、植株抗性分离等副作用，能加快新品种选育进程；本专利技术提供了一种能够通过两个PCR检测，明确ALS基因第1880位碱基为G(感咪草烟)，还是为A(抗咪草烟)的鉴定方法，从而能够快速筛选样品中是携带抗咪草烟，还是携带感咪草烟的基因型。本专利技术的准确性高、操作简单、检测效率高、成本低廉，具有很强的实用价值。附图说明:本专利技术的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：图1不同引物组合对日本晴和“金粳818”的PCR扩增结果A为日本晴，B为“金粳818”；M为DL2000标记，由大到小分别为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp和100bp；1-11分别为1、AS-ALSn-F2-1和AS-ALS-R1-1；2、AS-ALSn-F2-1和AS-ALS-R1本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于抗咪草烟除草剂基因型检测的功能标记AS‑ALS，其特征在于，所述抗咪草烟除草剂基因为ALS基因编码区第1880位碱基G转换为A的突变，其功能标记AS‑ALS包含两个引物组合：F1N和F1M；其中所述的F1N引物组合包含上下游两个引物：AS‑ALS‑F1与AS‑ALSn‑R2‑2；所述的F1M引物组合包含上下游两个引物：AS‑ALS‑F1与AS‑ALSm‑R2‑1；所述的AS‑ALS‑F1序列：5’‑GAGGCAATCATCGCTACTGG‑3’，所述的AS‑ALSn‑R2‑2序列：5’‑TGTCCTTGAATGCGCCCCTAC‑3’，所述的AS‑ALSm‑R2‑1序列：5’‑TGTCCTTGAATGCGCCCCTAT‑3’。

【技术特征摘要】
1.一种用于抗咪草烟除草剂基因型检测的功能标记AS-ALS，其特征在于，所述抗咪草烟除草剂基因为ALS基因编码区第1880位碱基G转换为A的突变，其功能标记AS-ALS包含两个引物组合：F1N和F1M；其中所述的F1N引物组合包含上下游两个引物：AS-ALS-F1与AS-ALSn-R2-2；所述的F1M引物组合包含上下游两个引物：AS-ALS-F1与AS-ALSm-R2-1；所述的AS-ALS-F1序列：5’-GAGGCAATCATCGCTACTGG-3’，所述的AS-ALSn-R2-2序列：5’-TGTCCTTGAATGCGCCCCTAC-3’，所述的AS-ALSm-R2-1序列：5’-TGTCCTTGAATGCGCCCCTAT-3’。2.根据权利要求1所述的功能标记AS-ALS，其特征在于，F1N引物组合能将含有感咪草烟ALS-G基因型的样品扩增出547bp条带...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨杰，王芳权，范方军，王军，李文奇，许扬，仲维功，杨睿，
申请(专利权)人：江苏省农业科学院，
类型：发明
国别省市：江苏,32