一种重组人PCSK9蛋白在CHO‑K1细胞中的表达纯化方法技术

本发明专利技术属于生物技术构建领域，具体公开了一种重组人PCSK9蛋白在CHO‑K1细胞中的表达纯化方法，包括真核表达载体pCMV‑pcsk9‑His的构建，CHO‑K1细胞的转染，细胞培养，重组人PCSK9蛋白的纯化等步骤，其中重组人PCSK9蛋白的纯化采用亲和层析、尺寸排阻层析、阴离子交换层析三步，获得的重组蛋白纯度更高，更加利于研究其功能和性质，减少PCSK9蛋白抑制剂筛选过程中的干扰。

The purification method of expression of recombinant human PCSK9 protein in CHO in K1 cells

The invention belongs to the field of construction of biotechnology, in particular discloses an expression of recombinant human PCSK9 protein in CHO K1 cell purification method, including the construction of eukaryotic expression vector pCMV PCSK9 His, CHO K1 cell transfection, cell culture, purification process of recombinant human PCSK9 protein, the purification of recombinant human PCSK9 protein by affinity chromatography and size exclusion chromatography, anion exchange chromatography step three, obtain a higher purity of the recombinant protein, more conducive to the study of its function and nature, reduce the interference of PCSK9 protein inhibitor screening process.

【技术实现步骤摘要】
一种重组人PCSK9蛋白在CHO-K1细胞中的表达纯化方法
本专利技术属于生物技术构建领域，具体涉及一种重组人PCSK9蛋白在CHO-K1细胞中的表达纯化方法。
技术介绍
人类的PCSK9基因在染色体1p32.3定位，全长为29kb，含有12个外显子，cDNA全长有3617个碱基，它的编码含有692个氨基酸残基的蛋白质，并且其编码的蛋白质被称为神经细胞凋亡调节转化酶1(NARC-1)，它是一个独特的前蛋白转化酶，而且是属于丝氨酸蛋白酶K亚类，它能切割非碱性氨基酸，其底物特异性是不同于其它前蛋白转化酶的，它的特定已知底物为前体PCSK9。人类的PCSK9氨基酸序列可以分为前结构域(31～152)、催化结构域(153～451)、信号肽(1～30)、富含半胱氨酸和组氨酸的C末端区域(452～692)。PCSK9的前体蛋白可以在内质网中合成一种可溶性酶原，即PCSK9酶原(apo-PCSK9)，在内质网或高尔基体中apo-PCSK9(151～152)的残基处能够发生自动催化分裂，并且能释放前肽形成成熟的蛋白酶分泌入血。PCSK9主要是在肝脏和小肠中表达，但是PCSK9只在肝脏表达才可分泌入血。血清低密度脂蛋白(lowdensitylipoproteincholesterol，LDL)水平是衡量血脂水平的主要指标，动脉粥样硬化性心脏病的主要危险因素是LDL升高，它可以诱发和促进动脉粥样硬化的发生和发展。PCSK9是除LDLR、载脂蛋白B-100(apolipoproteinB-100，apoB-100)和Niemann-PickC1Like1(NPC1L1))外，又1个与ADH相关基因，它可以在不影响LDLRmRNA水平的情况下，可以在蛋白质水平降解LDLR，从而影响LDL的代谢。流行病学研究已经发现在PCSK9基因的不同部位碱基突变能够导致2种大不相同的生物学效应。分别是功能获得型突变和功能确实型突变，功能获得型突变能够增强降解肝细胞LDLR的能力，从而能使LDL在血液中的清除减少，最终能够导致高胆固醇血症的发生，并且增加冠心病的易感性。功能缺失型突变能够使PCSK9的正常功能损坏，从而导致肝细胞LDLR的增多，并且血液中摄取LDL的降解增加，进一步引起低胆固醇血症，由于在肝脂质代谢调节中PCSK9起重要作用，所以PCSK9目前已经成为研发降脂药物的热门靶点。目前主要采用在体外建立稳定的表达细胞系和杆状病毒表达系统来表达PCSK9，但是没有出现系统的纯化方法的报道，没有进行纯化方法的优化，所获得的PCSK9纯度不高，活性较差。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种重组人PCSK9蛋白在CHO-K1细胞中的表达纯化方法，首次采用三步层析对重组PCSK9进行纯化，获得的重组蛋白纯度更高，更加利于研究其功能和性质，减少PCSK9抑制剂筛选过程中的干扰。本专利技术还提供了一种重组人PCSK9蛋白在CHO-K1细胞中的表达纯化方法，包括以下步骤：S1，真核表达载体pCMV-pcsk9-His的构建根据人pcsk9基因的cDNA序列合成pcsk9基因，然后将pcsk9基因整合入真核表达载体pCMV-C-His，得到真核表达载体pCMV-pcsk9-His；S2，CHO-K1细胞的转染培养CHO-K1细胞汇合度达到80％时，用真核表达载体pCMV-pcsk9-His转染CHO-K1细胞；S3，细胞培养、表达CHO-K1细胞转染后传代培养，在CHO-K1细胞表达出重组人PCSK9蛋白，得到CHO-K1细胞培养液；S4，重组人PCSK9蛋白的纯化S41，亲和层析S411，取NiSepharoseexcel树脂，装配成亲和层析柱，用BufferⅠ平衡NiSepharoseexcel树脂；S412，取CHO-K1细胞培养液，流经平衡好的NiSepharoseexcel树脂；S413，用BufferⅠ继续平衡NiSepharoseexcel树脂；S414，用BufferⅡ洗脱NiSepharoseexcel树脂，收集亲和层析洗脱液；S415，用截留分子量30KD超滤管将亲和层析洗脱液浓缩，得到浓缩液；S42，尺寸排阻层析S421，取Superdex200prepgrade树脂，装配成尺寸排阻层析柱，用BufferⅢ平衡Superdex200prepgrade树脂；S422，用所述浓缩液流经Superdex200prepgrade树脂，收集流出液；S423，用截留分子量30KD超滤管对15mL流出液进行溶液过滤，直至溶液的电导率值小于5mS/cm，弃去滤出液，收集截留液；S43，阴离子交换层析S431，取QsepharoseFastflow树脂，装配成阴离子交换层析柱，BufferⅣ平衡QsepharoseFastflow树脂；S432，将所述截留液流经QsepharoseFastflow树脂；S433，用BufferⅣ继续平衡QsepharoseFastflow树脂；S434，用BufferⅤ清洗QsepharoseFastflow树脂；S435，用BufferⅥ洗脱QsepharoseFastflow树脂，收集阴离子交换层析洗脱液；S436，用截留分子量30KD超滤管对阴离子交换层析洗脱液进行浓缩脱盐，得到纯化的重组人PCSK9蛋白；其中，BufferⅠ、BufferⅡ均由NaH2PO4、咪唑、NaCl、双蒸水配制而成，pH均为7.4；BufferⅢ、BufferⅣ、BufferⅤ、BufferⅥ均由NaH2PO4、NaCl、双蒸水配制而成，pH均为7.4。优选的，上述重组人PCSK9蛋白在CHO-K1细胞中的表达纯化方法，S411中，用BufferⅠ平衡NiSepharoseexcel树脂的流速为2mL/min；S412中，取CHO-K1细胞培养液，以2mL/min的流速流经平衡好的NiSepharoseexcel树脂；S413中，用BufferⅠ继续平衡NiSepharoseexcel树脂的流速为2mL/min。优选的，上述重组人PCSK9蛋白在CHO-K1细胞中的表达纯化方法，S421中，取120mL的Superdex200prepgrade树脂，装配成尺寸排阻层析柱，柱高60cm，柱直径是16mm，用BufferⅢ平衡Superdex200prepgrade树脂的流速为1mL/min；S422中，用所述浓缩液流经层析柱的流速为1mL/min。优选的，上述重组人PCSK9蛋白在CHO-K1细胞中的表达纯化方法，S431，取5mL的QsepharoseFastflow树脂，装配成阴离子交换层析柱，柱高7cm，柱直径10mm，BufferⅣ平衡QsepharoseFastflow树脂，流速为1mL/min；S432，将所述截留液以1mL/min的流速流经衡QsepharoseFastflow树脂；S433，用BufferⅣ继续平衡QsepharoseFastflow树脂，流速是2mL/min；S434，用BufferⅤ清洗QsepharoseFastflow树脂，流速为1mL/min。优选的，上述重组人PCSK9蛋白在CHO-K1细胞中的表达纯化方法，每升BufferⅠ中含有50mmolNaH2PO4、20mmol咪唑、300本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种重组人PCSK9蛋白在CHO‑K1细胞中的表达纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：S1，真核表达载体pCMV‑pcsk9‑His的构建根据人pcsk9基因的cDNA序列合成pcsk9基因，然后将pcsk9基因整合入真核表达载体pCMV‑C‑His，得到真核表达载体pCMV‑pcsk9‑His；S2，CHO‑K1细胞的转染培养CHO‑K1细胞汇合度达到80％时，用真核表达载体pCMV‑pcsk9‑His转染CHO‑K1细胞；S3，细胞培养、表达CHO‑K1细胞转染后传代培养，在CHO‑K1细胞表达出重组人PCSK9蛋白，得到CHO‑K1细胞培养液；S4，重组人PCSK9蛋白的纯化S41，亲和层析S411，取Ni Sepharose excel树脂，装配成亲和层析柱，用BufferⅠ平衡Ni Sepharose excel树脂；S412，取CHO‑K1细胞培养液，流经平衡好的Ni Sepharose excel树脂；S413，用BufferⅠ继续平衡Ni Sepharose excel树脂；S414，用BufferⅡ洗脱Ni Sepharose excel树脂，收集亲和层析洗脱液；S415，用截留分子量30KD超滤管将亲和层析洗脱液浓缩，得到浓缩液；S42，尺寸排阻层析S421，取Superdex 200 prep grade树脂，装配成尺寸排阻层析柱，用Buffer Ⅲ平衡Superdex 200 prep grade树脂；S422，用所述浓缩液流经Superdex 200 prep grade树脂，收集流出液；S423，用截留分子量30KD超滤管对15mL流出液进行溶液过滤，直至溶液的电导率值小于5mS/cm，弃去滤出液，收集截留液；S43，阴离子交换层析S431，取Q sepharose Fast flow树脂，装配成阴离子交换层析柱，BufferⅣ平衡Q sepharose Fast flow树脂；S432，将所述截留液流经Q sepharose Fast flow树脂；S433，用BufferⅣ继续平衡Q sepharose Fast flow树脂；S434，用BufferⅤ清洗Q sepharose Fast flow树脂；S435，用BufferⅥ洗脱Q sepharose Fast flow树脂，收集阴离子交换层析洗脱液；S436，用截留分子量30KD超滤管对阴离子交换层析洗脱液进行浓缩脱盐，得到纯化的重组人PCSK9蛋白；其中，BufferⅠ、BufferⅡ均由NaH2PO4、咪唑、NaCl、双蒸水配制而成，pH均为7.4；BufferⅢ、BufferⅣ、BufferⅤ、BufferⅥ均由NaH2PO4、NaCl、双蒸水配制而成，pH均为7.4。...

【技术特征摘要】
1.一种重组人PCSK9蛋白在CHO-K1细胞中的表达纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：S1，真核表达载体pCMV-pcsk9-His的构建根据人pcsk9基因的cDNA序列合成pcsk9基因，然后将pcsk9基因整合入真核表达载体pCMV-C-His，得到真核表达载体pCMV-pcsk9-His；S2，CHO-K1细胞的转染培养CHO-K1细胞汇合度达到80％时，用真核表达载体pCMV-pcsk9-His转染CHO-K1细胞；S3，细胞培养、表达CHO-K1细胞转染后传代培养，在CHO-K1细胞表达出重组人PCSK9蛋白，得到CHO-K1细胞培养液；S4，重组人PCSK9蛋白的纯化S41，亲和层析S411，取NiSepharoseexcel树脂，装配成亲和层析柱，用BufferⅠ平衡NiSepharoseexcel树脂；S412，取CHO-K1细胞培养液，流经平衡好的NiSepharoseexcel树脂；S413，用BufferⅠ继续平衡NiSepharoseexcel树脂；S414，用BufferⅡ洗脱NiSepharoseexcel树脂，收集亲和层析洗脱液；S415，用截留分子量30KD超滤管将亲和层析洗脱液浓缩，得到浓缩液；S42，尺寸排阻层析S421，取Superdex200prepgrade树脂，装配成尺寸排阻层析柱，用BufferⅢ平衡Superdex200prepgrade树脂；S422，用所述浓缩液流经Superdex200prepgrade树脂，收集流出液；S423，用截留分子量30KD超滤管对15mL流出液进行溶液过滤，直至溶液的电导率值小于5mS/cm，弃去滤出液，收集截留液；S43，阴离子交换层析S431，取QsepharoseFastflow树脂，装配成阴离子交换层析柱，BufferⅣ平衡QsepharoseFastflow树脂；S432，将所述截留液流经QsepharoseFastflow树脂；S433，用BufferⅣ继续平衡QsepharoseFastflow树脂；S434，用BufferⅤ清洗QsepharoseFastflow树脂；S435，用BufferⅥ洗脱QsepharoseFastflow树脂，收集阴离子交换层析洗脱液；S436，用截留分子量30KD超滤管对阴离子交换层析洗脱液进行浓缩脱盐，得到纯化的重组人PCSK9蛋白；其中，BufferⅠ、BufferⅡ均由NaH2PO4、咪唑、NaCl、双蒸水配制而成，pH均为7.4；BufferⅢ、BufferⅣ、BufferⅤ、BufferⅥ均由NaH2PO4、NaCl、...

【专利技术属性】
技术研发人员：吕志俭，兰翀，吴敏，豆艳丽，
申请(专利权)人：黄河科技学院，
类型：发明
国别省市：河南,41