超临界CO2流体色谱技术制备肠激酶工艺制造技术

本发明专利技术公开了生物技术领域的一种超临界CO2流体色谱技术制备肠激酶工艺，本发明专利技术提供了包含肠激酶基因的表达载体和工程菌，还提供了肠激酶的制备方法，包括培养工程菌、收获工程菌菌体、破碎得包涵体、洗涤和溶解包涵体、复性、酶原活化及纯化肠激酶的步骤。 本发明专利技术的方法是重组肠激酶制备工艺成熟、质量稳定、纯度高、成本低，适合药用蛋白生产。

Preparation of intestinal kinase by supercritical CO2 fluid chromatography

The invention discloses a biological technology of CO2 supercritical fluid chromatography preparation of enterokinase technology, the invention provides expression vectors and gene engineering bacteria containing enterokinase, also provides a method for preparing enterokinase, including the training of engineering bacteria, fungus, broken harvest project, and inclusion body washing the inclusion body dissolved, renaturation and purification of enterokinase, plasminogen activation steps. The method of the invention is recombinant enterokinase preparation process is mature, stable quality, high purity, low cost, suitable for the production of pharmaceutical proteins.

【技术实现步骤摘要】
超临界CO2流体色谱技术制备肠激酶工艺
本专利技术涉及生物
的一种超临界CO2流体色谱技术制备肠激酶工艺。
技术介绍
肠激酶(Enterokinase，EK)是存在于哺乳动物十二指肠内的一种异源二聚体丝氨酸蛋白酶(EC3.4.21.9)。天然肠激酶分子量为150kDa，由1条115kDa重链和1条35kD轻链组成，重链负责在消化道细胞膜上的锚定以及与肠激酶融合蛋白的结合，轻链具有催化活性，可以特异性识别Asp-Asp-Asp-Asp-Lys序列并在其羧基端切割，将肠激酶融合蛋白活化为肠激酶，从而启动消化道内各种酶原活化的级联反应。由于肠激酶识别位点的特异性和切割后在目标蛋白N末端不留任何氨基酸残基，而且可以在pH4.5～9.5、温度4～45℃范围内特异性水解蛋白底物，因此它已经成为基因工程制药领域融合蛋白切割的的首选工具酶，广泛应用于各种重组蛋白、多肽药物的加工成熟。天然的肠激酶来源有限，需从动物组织分离提取，因为从动物组织提取的肠激酶易残留其他的蛋白酶，对融合蛋白的产生降解；另外，来源于动物组织的肠激酶可能带有未知病毒等动物源性污染，为药物蛋白生产增加了额外的风险。通过基因工程的方法生产的肠激酶轻链，具有天然肠激酶的全酶活性和特异性，在融合蛋白切割中被广泛应用。已有报道的重组肠激酶轻链多为实验室级别，存在大量宿主蛋白残留、镍离子残留和其他杂质，而且作为原辅料进行药物蛋白生产时，其残留不能被有效检测和控制，对药用蛋白的生产中增加许多风险。
技术实现思路
本专利技术提供一种重组肠激酶的制备方法，以克服现有技术中重组肠激酶轻链多为实验室规模制备，存在大量宿主蛋白残留、镍离子残留和其他杂质的技术缺陷。本专利技术是通过以下技术方案实现的：一种超临界CO2流体色谱技术制备肠激酶工艺，其特征在于：工艺步骤如下：培养包含肠激酶基因的工程菌并诱导肠激酶基因表达，具体为：接种重组工程菌阳性克隆到LB培养基中，于30-40℃下摇床振荡培养过夜，按1-10％接种量接过夜菌于LB培养基中，37℃下摇床振荡培养到对数期，按1-10％接种量接种到装有发酵培养基的发酵罐中，调节搅拌转速与通气量以维持溶氧在35％以上，发酵培养基配方如下：酵母浸出粉20g/L，葡萄糖6g/L，十二水合磷酸氢二钠8g/L，磷酸二氢钾4g/L，硫酸铵6g/L，七水硫酸镁1.13g/L，二水氯化钙0.073g/L，补料培养基：酵母浸出粉20g/L，葡萄糖30g/L，50％氨水和30％磷酸用于发酵过程中pH调控，当培养基中养分耗尽，溶氧迅速上升时开始补料，调节补料速度、转速、通气控制溶氧在30％以上，补料4h后，降温至23℃，调节pH至7.0，加入终浓度为0.1-0.5mmol/L的IPTG进行有氧诱导，继续培养6h放罐；培养包含肠激酶基因的工程菌并诱导肠激酶基因表达，具体为：接种重组工程菌阳性克隆200μl到20ml的LB培养基中，于30℃下摇床振荡培养过夜，按4％接种量接过夜菌于500ml的LB培养基中，37℃下摇床振荡培养到对数期，接种到装有6L发酵培养基的发酵罐中，初始参数为：发酵温度37℃，搅拌速度200rpm，通气量15L/min，pH为6.7，调节搅拌转速与通气量以维持溶氧始终在35％以上，发酵培养基如下：酵母浸出粉20g/L，葡萄糖6g/L，十二水合磷酸氢二钠8g/L，磷酸二氢钾4g/L，硫酸铵6g/L，七水硫酸镁1.13g/L，二水氯化钙0.073g/L，补料培养基：酵母浸出粉20g/L，葡萄糖30g/L，50％氨水和30％磷酸用于发酵过程中pH调控；当培养基中养分耗尽，溶氧迅速上升时开始补料，通过控制泵的转速合理控制补料速度，控制溶氧在30％以上，补料4h后，降温至23℃，调节pH至7.0，加入终浓度为0.3mmol/L的IPTG进行有氧诱导，控制溶氧不低于20％，6h后出罐；破碎菌体的缓冲液为25mmol/LTris-HCl+5mmol/LEDTA，PH7.5；洗涤包涵体的缓冲液为2mol/L尿素+1.5％Triton；包涵体复性的缓冲液为0.2mol/L尿素+10mmol/LEDTA+25mmol/LTis-HCL，GSH∶GSSG＝1mmol/L∶0.3mmol/L，PH10；肠激酶原活化的条件是经肠激酶在室温下酶解2-10小时，肠激酶/肠激酶原重量比为1/200；活性肠激酶的纯化依次包括阴离子层析纯化、阳离子层析纯化和疏水层析纯化步骤。具体实施方式下面通过具体操作工艺对本专利技术的内容作进一步的说明：首先接种重组工程菌阳性克隆到LB培养基中，于30-40℃下摇床振荡培养过夜，按1-10％接种量接过夜菌于LB培养基中，37℃下摇床振荡培养到对数期，按1-10％接种量接种到装有发酵培养基的发酵罐中，调节搅拌转速与通气量以维持溶氧在35％以上，发酵培养基配方如下：酵母浸出粉20g/L，葡萄糖6g/L，十二水合磷酸氢二钠8g/L，磷酸二氢钾4g/L，硫酸铵6g/L，七水硫酸镁1.13g/L，二水氯化钙0.073g/L，补料培养基：酵母浸出粉20g/L，葡萄糖30g/L，50％氨水和30％磷酸用于发酵过程中pH调控，当培养基中养分耗尽，溶氧迅速上升时开始补料，调节补料速度、转速、通气控制溶氧在30％以上，补料4h后，降温至23℃，调节pH至7.0，加入终浓度为0.1-0.5mmol/L的IPTG进行有氧诱导，继续培养6h放罐；培养包含肠激酶基因的工程菌并诱导肠激酶基因表达，具体为：接种重组工程菌阳性克隆200μl到20ml的LB培养基中，于30℃下摇床振荡培养过夜，按4％接种量接过夜菌于500ml的LB培养基中，37℃下摇床振荡培养到对数期，接种到装有6L发酵培养基的发酵罐中，初始参数为：发酵温度37℃，搅拌速度200rpm，通气量15L/min，pH为6.7，调节搅拌转速与通气量以维持溶氧始终在35％以上，发酵培养基如下：酵母浸出粉20g/L，葡萄糖6g/L，十二水合磷酸氢二钠8g/L，磷酸二氢钾4g/L，硫酸铵6g/L，七水硫酸镁1.13g/L，二水氯化钙0.073g/L，补料培养基：酵母浸出粉20g/L，葡萄糖30g/L，50％氨水和30％磷酸用于发酵过程中pH调控；当培养基中养分耗尽，溶氧迅速上升时开始补料，通过控制泵的转速合理控制补料速度，控制溶氧在30％以上，补料4h后，降温至23℃，调节pH至7.0，加入终浓度为0.3mmol/L的IPTG进行有氧诱导，控制溶氧不低于20％，6h后出罐；破碎菌体的缓冲液为25mmol/LTris-HCl+5mmol/LEDTA，PH7.5；洗涤包涵体的缓冲液为2mol/L尿素+1.5％Triton；包涵体复性的缓冲液为0.2mol/L尿素+10mmol/LEDTA+25mmol/LTis-HCL，GSH∶GSSG＝1mmol/L∶0.3mmol/L，PH10；肠激酶原活化的条件是经肠激酶在室温下酶解2-10小时，肠激酶/肠激酶原重量比为1/200；活性肠激酶的纯化依次包括阴离子层析纯化、阳离子层析纯化和疏水层析纯化步骤。本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种超临界CO2流体色谱技术制备肠激酶工艺，其特征在于：工艺步骤如下：培养包含肠激酶基因的工程菌并诱导肠激酶基因表达，具体为：接种重组工程菌阳性克隆到LB培养基中，于30‑40℃下摇床振荡培养过夜，按1‑10％接种量接过夜菌于LB培养基中，37℃下摇床振荡培养到对数期，按1‑10％接种量接种到装有发酵培养基的发酵罐中，调节搅拌转速与通气量以维持溶氧在35％以上，发酵培养基配方如下：酵母浸出粉20g/L，葡萄糖6g/L，十二水合磷酸氢二钠8g/L，磷酸二氢钾4g/L，硫酸铵6g/L，七水硫酸镁1.13g/L，二水氯化钙0.073g/L，补料培养基：酵母浸出粉20g/L，葡萄糖30g/L，50％氨水和30％磷酸用于发酵过程中pH调控，当培养基中养分耗尽，溶氧迅速上升时开始补料，调节补料速度、转速、通气控制溶氧在30％以上，补料4h后，降温至23℃，调节pH至7.0，加入终浓度为0.1‑0.5mmol/L的IPTG进行有氧诱导，继续培养6h放罐。

【技术特征摘要】
1.一种超临界CO2流体色谱技术制备肠激酶工艺，其特征在于：工艺步骤如下：培养包含肠激酶基因的工程菌并诱导肠激酶基因表达，具体为：接种重组工程菌阳性克隆到LB培养基中，于30-40℃下摇床振荡培养过夜，按1-10％接种量接过夜菌于LB培养基中，37℃下摇床振荡培养到对数期，按1-10％接种量接种到装有发酵培养基的发酵罐中，调节搅拌转速与通气量以维持溶氧在35％以上，发酵培养基配方如下：酵母浸出粉20g/L，葡萄糖6g/L，十二水合磷酸氢二钠8g/L，磷酸二氢钾4g/L，硫酸铵6g/L，七水硫酸镁1.13g/L，二水氯化钙0.073g/L，补料培养基：酵母浸出粉20g/L，葡萄糖30g/L，50％氨水和30％磷酸用于发酵过程中pH调控，当培养基中养分耗尽，溶氧迅速上升时开始补料，调节补料速度、转速、通气控制溶氧在30％以上，补料4h后，降温至23℃，调节pH至7.0，加入终浓度为0.1-0.5mmol/L的IPTG进行有氧诱导，继续培养6h放罐。2.根据权利要求1所述的超临界CO2流体色谱技术制备肠激酶工艺，其特征在于：培养包含肠激酶基因的工程菌并诱导肠激酶基因表达，具体为：接种重组工程菌阳性克隆200μl到20ml的LB培养基中，于30℃下摇床振荡培养过夜，按4％接种量接过夜菌于500ml的LB培养基中，37℃下摇床振荡培养到对数期，接种到装有6L发酵培养基的发酵罐中，初始参数为：发酵温度37℃，搅拌速度200rpm，通气量15L/min，pH为6.7，调节搅拌转速与通气量以维持溶氧始终在35％以上，发酵培养基如下：酵...

【专利技术属性】
技术研发人员：费苹，陈银芳，费正明，陈明全，
申请(专利权)人：如皋市永兴肠衣有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32