一种具有肝癌HepG2细胞抑制活性的根皮苷三乙酯的制备方法技术

本发明专利技术涉及一种非水相酶促催化法制备根皮苷三乙酯的方法，其反应条件温和，生产能耗小，环境友好，本发明专利技术采用的技术方案包括以下步骤：（1）根皮苷、乙酸乙烯酯和脂肪酶在反应器内混合均匀，在30‑60℃密闭条件下，振荡反应24‑72h后终止反应；（2）经过滤除去脂肪酶，将上清液旋转蒸发至油状物加入适量丙酮溶解，使用配有C18预装柱的快速制备色谱进行分离；（3）将收集的溶液浓缩，冷冻干燥，得产物。该产物具有抑制肝癌HepG2细胞活性，在功能性食品领域具有应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种具有肝癌HepG2细胞抑制活性的根皮苷三乙酯的制备方法
本专利技术涉及一种具有肝癌HepG2细胞抑制活性的根皮苷三乙酯的制备方法，本专利技术的制备工艺简单，所得产物具有肝癌HepG2细胞抑制活性，其在功能性食品领域具有应用前景。
技术介绍
研究表明，约有35%的肿瘤与膳食因素有关。从膳食因素与肿瘤的发生关系来看，改变膳食营养和生活习惯可以降低肿瘤的发生率，尤其在癌前病变阶段，改变不良生活方式或食用一些具有抗肿瘤作用的功能食品，对抗癌前病变具有重要作用。目前开发的功能食品，要求其具有抗氧化作用、诱导细胞周期停滞和细胞凋亡、提高机体免疫力、诱导细胞间隙连接通讯、抗突变、抗畸变。要实现这些作用需要充分合理地应用各种生理活性物质，也需要合理地搭配各种基本营养素，以充分发挥抗肿瘤食品的保健作用和最大限度地调动机体的免疫功能。根皮苷是根皮素的葡萄糖苷，属于二氢查尔酮类物质，其主要存在于苹果树的根皮、茎、嫩叶以及苹果果实中,近年来在多穗柯甜茶中也发现了含量比较丰富的根皮苷。但根皮苷脂溶性均不佳，导致其降低其生物利用度不高,限制了其的应用范围。酯化是提高天然产物生物活性的常用策略。目前酯化衍生主要采用酸酐或酰氯，进行化学酰化，但根皮苷上羟基众多、环境相近，为合成带来了较大困难。该法存在着反应区域选择性差，目的产物产率低、分离困难等缺点。若采用基团保护及脱保护等措施，又存在步骤繁多，耗时长，且引入溶剂多、环境不友好等缺点。而传统的非水相酶催化虽具有有高效、高选择性的特点，但其大多使用有机溶剂、离子液体为反应介质，获得的产物主要为单酯化衍生物。而本专利技术则采用无溶剂体系的非水相酶促法，将乙酸乙烯酯作为酰基供体和反应介质，以脂肪酶为催化剂合成了根皮苷三乙酯，其对肝癌HepG2细胞具有很好的抑制效果，在功能性食品领域具有广阔的应用前景，对我国苹果资源的综合开发和产业链延伸也具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术的主要目的是提供一种具有肝癌HepG2细胞抑制活性的根皮苷三乙酯的制备方法，本专利技术的技术方案是：一种具有肝癌HepG2细胞抑制活性的根皮苷三乙酯的制备方法，包括以下步骤：(1)用乙酸乙烯酯将根皮苷(纯度≥98％)溶解完全，而后加入脂肪酶，反应体系中根皮苷的浓度0.5-2mg/mL，脂肪酶的浓度2-12mg/mL。将所得混合物在30-60℃下密闭，振荡反应24-72h后终止反应。(2)将步骤(1)所得反应混合物中的脂肪酶滤除，并将溶液旋转蒸发至油状物加入适量丙酮溶解，使用配有C18预装柱的快速制备色谱进行分离，流动相由甲醇和纯水构成，采用梯度洗脱，洗脱程序如表1，检测波长为280nm。(3)将步骤(2)所得洗脱液真空浓缩，冷冻干燥(温度为-60~-40℃,真空度低于0.08Pa)，得产品。表1洗脱程序时间（min）甲醇（%）纯水（%）0208052080107030本专利技术的优点与效果：（1）根皮苷为苹果深加工副产物，来源广泛，以其为原料制备的根皮苷三乙酯具有很强的肝癌HepG2细胞抑制活性，因而本专利技术具有很强的实用性，对我国苹果资源的综合开发和产业链延伸具有重要意义。（2）本专利技术的生产工艺简单，并且提取和纯化步骤中所用的有机溶剂均能有效回收，节约了生产成本，因此本专利技术具有广阔的市场前景。附图说明图1为本专利技术所述的根皮苷三乙酯紫外光谱；图2为本专利技术所述的根皮苷三乙酯的红外光谱；图3为本专利技术所述的根皮苷三乙酯的质谱（正离子模式）；图4为本专利技术所述的根皮苷三乙酯的1H-NMR图谱；图5为本专利技术所述的根皮苷三乙酯13C-NMR图谱；图6为本专利技术所述的根皮苷三乙酯抑制肝癌HepG2细胞效果。具体实施方式为详细介绍本专利技术的实施，列举如下实施方式，但本专利技术的保护范围不受下列实施例的限制。实施例1用35mL乙酸乙烯酯将60mg根皮苷(纯度≥98％)溶解完全，而后加入脂肪酶(LipozymeIMRM)250mg。将所得混合物在50℃下密闭，振荡反应60h后终止反应。滤除反应液中的脂肪酶，并将滤液旋转蒸发至油状物加入15mL丙酮溶解，使用配有C18预装柱的快速制备色谱进行分离纯化，流动相由甲醇和纯水构成，采用梯度洗脱，洗脱程序如表1，检测波长为280nm。所得洗脱液真空浓缩，冷冻干燥(温度为-50℃,真空度0.05Pa)，得根皮苷三乙酯26.1mg。实施例2用40mL乙酸乙烯酯将45mg根皮苷(纯度≥98％)溶解完全，而后加入脂肪酶(LipozymeIMTL)100mg。将所得混合物在40℃下密闭，振荡反应72h后终止反应。滤除反应液中的脂肪酶，并将滤液旋转蒸发至油状物加入10mL丙酮溶解，使用配有C18预装柱的快速制备色谱进行分离纯化，流动相由甲醇和纯水构成，采用梯度洗脱，洗脱程序如表1，检测波长为280nm。所得洗脱液真空浓缩，冷冻干燥(温度为-40℃,真空度0.04Pa)，得根皮苷三乙酯18.16mg。实施例3用30mL乙酸乙烯酯将50mg根皮苷(纯度≥98％)溶解完全，而后加入脂肪酶(Novozym435)150mg。将所得混合物在45℃下密闭，振荡反应48后终止反应。滤除反应液中的脂肪酶，并将滤液旋转蒸发至油状物加入适量10mL丙酮溶解，使用配有C18预装柱的快速制备色谱进行分离纯化，流动相由甲醇和纯水构成，采用梯度洗脱，洗脱程序如表1，检测波长为280nm。所得洗脱液真空浓缩，冷冻干燥(温度为-50℃,真空度0.06Pa)，得根皮苷三乙酯29.07mg。本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种利用脂肪酶催化合成根皮苷三乙酯的方法，其特征在于：所述的方法为用脂肪酶催化根皮苷及乙酸乙烯酯合成根皮苷三乙酯。

【技术特征摘要】
1.一种利用脂肪酶催化合成根皮苷三乙酯的方法，其特征在于：所述的方法为用脂肪酶催化根皮苷及乙酸乙烯酯合成根皮苷三乙酯。2.根据权利要求1所述的利用脂肪酶催化合成根皮苷三乙酯的方法，其特征在于：所述的脂肪酶包括：脂肪酶Novozym435、脂肪酶PSL-C、脂肪酶LipozymeIMTL、脂肪酶LipozymeIMRM、脂肪酶LipozymeIM。3.根据权利要求1所述的利用脂肪酶催化合成根皮苷三乙酯的方法，其特征在于：所述的具体合成方法为：(1)根皮苷、乙酸乙烯酯和脂肪酶在反应器内混合均匀，在一定温度下密闭，振荡反应一段时间后终止反应；(2)经过滤除去脂肪酶，将溶液旋转蒸发至油状物加入适量丙酮溶解，使用快速制备...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘本国，陈玉珍，刘江伟，耿升，马汉军，
申请(专利权)人：河南科技学院，
类型：发明
国别省市：河南,41