一种快速色谱制备非达霉素的方法技术

本发明专利技术提供一种快速色谱制备非达霉素的方法，该方法包括以下步骤：首先将非达霉素发酵菌丝体以60％～80％乙醇浸提，浸提液经过聚苯乙烯树脂粗分，收集含有非达霉素的馏分；然后将该馏分先后进行两次反相键合相硅胶快速柱色谱分离，采用的是两种不同选择性的洗脱溶剂；最终获得纯度98.5％以上的非达霉素精制品。本发明专利技术方法不仅所得非达霉素的纯度与收率高，而且操作相对简单、成本较低，并适用于工业化生产。

A rapid method for the preparation of azithromycin by chromatography

The present invention provides a fast chromatographic method for preparing non fidaxomicin, the method comprises the following steps: firstly, fidaxomicin fermentation mycelium from 60% to 80% ethanol extraction, extraction by polystyrene resin crude, collection containing fidaxomicin fraction; then the fractions were two times reversed-phase bonded phase silica gel column chromatography after the first fast, is used in two different elution solvent selectivity; finally obtained more than 98.5% purity fidaxomicin product. The method of the invention not only has the advantages of high purity and yield, but relatively simple operation and low cost, and is suitable for industrial production.

【技术实现步骤摘要】
一种快速色谱制备非达霉素的方法
本专利技术属于微生物制药领域，具体涉及一种快速色谱制备非达霉素的方法。
技术介绍
艰难梭菌是一种革兰氏阳性厌氧芽孢杆菌，广泛分布于自然环境及动物和人的粪便中。其过度生长并释放毒素时，可引起艰难梭菌感染(CDI)，导致结肠炎症、严重腹泻甚至死亡。非达霉素(fidaxomicin)是Optimer制药公司研发的一种新型窄谱的大环内酯类抗生素，于2011年5月获得FDA批准在美国上市，成为30年来首个主要用于治疗艰难梭菌相关性腹泻(CDAD)的抗生素。非达霉素通过抑制艰难梭菌的RNA聚合酶，阻断核糖核酸合成而杀菌。与传统药物万古霉素相比，它可显著降低艰难梭菌感染的复发率并提高整体治愈率。非达霉素的结构如下：现有技术中，从发酵液中提取纯化非达霉素的方法有：中国专利CN104846043A公开了一种从发酵液中分离和纯化非达霉素的工艺；该工艺采用极性有机溶剂浸提菌丝体；浸提液通过大孔吸附树脂柱并解吸；解吸液用有机溶剂萃取，再经过正相柱层析，得到非达霉素粗品；该粗品经高压液相色谱设备，以有机溶剂/酸水洗脱，收集高纯度非达霉素流出液；洗脱液再经聚苯乙烯微球树脂柱层析；洗脱液萃取、浓缩、干燥，得到白色粉末状非达霉素纯品，纯度96％～97％，收率约73％。该工艺步骤繁琐，而且使用了高压液相设备，仅适合于实验室操作。中国专利CN104418925A公开了一种制备高纯度非达霉素的方法；该方法将从非达霉素发酵液中分离出的菌丝体用极性有机溶剂浸提；浸提液加水稀释后导入大孔吸附树脂SP825L吸附，然后对树脂柱进行净化和解吸，得到非达霉素的粗品解吸液Ⅰ，浓缩、结晶后得非达霉素粗品；非达霉素粗品用乙腈的水溶液溶解后，导入UniPS40树脂柱，经洗脱得到非达霉素洗脱液Ⅱ，蒸除溶解得到固体，再用极性有机溶剂重结晶，得到非达霉素产品。该方法收率50％～60％，纯度98.5％以上，但需一次或多次结晶，操作较为繁琐。中国专利CN104098637A公开了一种非达霉素的纯化方法；该方法将非达霉素发酵液进行固液分离得到菌丝体，接着用有机溶剂浸泡菌丝体得到含非达霉素的溶液；将该溶液进行纳滤浓缩；浓缩液通过装有C8填料的DAC200制备柱层析，并用含有有机溶剂的酸水溶液进行洗脱，收集、合并含非达霉素的馏分，加水逼出非达霉素，过滤、干燥得到非达霉素干粉，且收率达到50％以上、纯度达到99.5％以上。该法操作简单、获得非达霉素纯度及收率高，但是由于采用了动态轴向压缩柱(DAC)技术，对设备和填料规格要求较高，成本投入较大。因此，从发酵液中提取纯化非达霉素的方法仍需进行优化改进，以期得到一种具有如下优点的方法：纯度和收率高，同时操作相对简单、成本投入较低，且适用于工业化生产。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题在于提供一种快速色谱制备非达霉素的方法，不仅所得非达霉素的纯度与收率高，而且操作相对简单、成本较低，并适用于工业化生产。本专利技术是通过以下技术方案解决上述技术问题的：一种快速色谱制备非达霉素的方法，包括如下具体操作步骤：(1)、将非达霉素发酵液进行固液分离得到菌丝体，然后加入60％～80％乙醇浸泡菌丝体并离心，得到非达霉素浸提液，待用；(2)、将步骤(1)所得的非达霉素浸提液用水稀释至乙醇浓度为10％～40％，之后导入聚苯乙烯树脂柱内进行吸附，然后采用乙醇进行梯度解吸，收集非达霉素含量45％以上的解吸液；(3)、将步骤(2)所收集的解吸液合并，并加水稀释至乙醇浓度为45％～55％，接着导入反相硅胶层析柱中，采用甲醇-水-乙酸进行梯度洗脱，收集非达霉素含量85％以上的洗脱液；(4)、将步骤(3)所收集到的洗脱液合并，并采用水稀释至甲醇浓度为55％～65％，再次导入反相硅胶层析柱中，采用乙腈-水-乙酸进行梯度洗脱，收集非达霉素含量98.5％以上的洗脱液并进行合并，进行浓缩、干燥后得到高纯度的非达霉素成品。进一步地，所述步骤(1)中，60％～80％乙醇的加入量为每千克湿的菌丝体中加入1～8升；浸提温度为10～50℃；浸提时间为2～8h。进一步地，所述步骤(2)中，聚苯乙烯树脂柱为DIAIONHP-20聚苯乙烯树脂柱、纳微NM-200聚苯乙烯树脂柱、D101聚苯乙烯树脂柱、HPD-400聚苯乙烯树脂柱、AmberliteXAD-8聚苯乙烯树脂柱或HZ816聚苯乙烯树脂柱中的任一种。进一步地，所述步骤(3)中，反相硅胶层析柱的填料选用C4、C8或C18烷基硅胶键合相中的任一种，且粒径为50μm。进一步地，所述步骤(4)中，反相硅胶层析柱的填料选用C4、C8或C18烷基硅胶键合相中的任一种，且粒径为50μm。本专利技术的有益效果在于：提供一种快速色谱制备非达霉素的方法，不仅能够快速便捷的获得非达霉素，而且所获得的非达霉素的纯度与收率均高，此外，整个方法操作相对简单、成本较低，能够适用于工业化生产。【附图说明】下面参照附图结合实施例对本专利技术作进一步的描述。图1是本专利技术实施例1-3中浸提液的HPLC色谱图。图2是本专利技术实施例1中解吸液的HPLC色谱图。图3是本专利技术实施例1中所收集非达霉素含量85％以上的洗脱液的HPLC色谱图。图4是本专利技术实施例1中所收集非达霉素含量98.5％以上的洗脱液的HPLC色谱图。图5是本专利技术实施例2中解吸液的HPLC色谱图。图6是本专利技术实施例2中所收集非达霉素含量85％以上的洗脱液的HPLC色谱图。图7是本专利技术实施例2中所收集非达霉素含量98.5％以上的洗脱液的HPLC色谱图。图8是本专利技术实施例3中解吸液的HPLC色谱图。图9是本专利技术实施例3中所收集非达霉素含量85％以上的洗脱液的HPLC色谱图。图10是本专利技术实施例3中所收集非达霉素含量98.5％以上的洗脱液的HPLC色谱图。【具体实施方式】本专利技术一种快速色谱制备非达霉素的方法，包括如下具体操作步骤：(1)、将非达霉素发酵液进行固液分离得到菌丝体，然后加入60％～80％乙醇浸泡菌丝体并离心，得到非达霉素浸提液，待用；(2)、将步骤(1)所得的非达霉素浸提液用水稀释至乙醇浓度为10％～40％，之后导入聚苯乙烯树脂柱内进行吸附，然后采用乙醇进行梯度解吸，收集非达霉素含量45％以上的解吸液；(3)、将步骤(2)所收集的解吸液合并，并加水稀释至乙醇浓度为45％～55％，接着导入反相硅胶层析柱中，采用甲醇-水-乙酸进行梯度洗脱，收集非达霉素含量85％以上的洗脱液；(4)、将步骤(3)所收集到的洗脱液合并，并采用水稀释至甲醇浓度为55％～65％，再次导入反相硅胶层析柱中，采用乙腈-水-乙酸进行梯度洗脱，收集非达霉素含量98.5％以上的洗脱液并进行合并，进行浓缩、干燥后得到高纯度的非达霉素成品。其中，步骤(1)中，60％～80％乙醇的加入量为每千克湿的菌丝体中加入1～8升；浸提温度为10～50℃；浸提时间为2～8h。步骤(2)中，聚苯乙烯树脂柱为DIAIONHP-20聚苯乙烯树脂柱、纳微NM-200聚苯乙烯树脂柱、D101聚苯乙烯树脂柱、HPD-400聚苯乙烯树脂柱、AmberliteXAD-8聚苯乙烯树脂柱或HZ816聚苯乙烯树脂柱中的任一种；可以优选纳微NM-200聚苯乙烯树脂柱或HZ816聚苯乙烯树脂柱。步骤(3)中，反相硅胶层析柱的填料选用C4、C本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种快速色谱制备非达霉素的方法，其特征在于：包括如下具体操作步骤：(1)、将非达霉素发酵液进行固液分离得到菌丝体，然后加入60％～80％乙醇浸泡菌丝体并离心，得到非达霉素浸提液，待用；(2)、将步骤(1)所得的非达霉素浸提液用水稀释至乙醇浓度为10％～40％，之后导入聚苯乙烯树脂柱内进行吸附，然后采用乙醇进行梯度解吸，收集非达霉素含量45％以上的解吸液；(3)、将步骤(2)所收集的解吸液合并，并加水稀释至乙醇浓度为45％～55％，接着导入反相硅胶层析柱中，采用甲醇‑水‑乙酸进行梯度洗脱，收集非达霉素含量85％以上的洗脱液；(4)、将步骤(3)所收集到的洗脱液合并，并采用水稀释至甲醇浓度为55％～65％，再次导入反相硅胶层析柱中，采用乙腈‑水‑乙酸进行梯度洗脱，收集非达霉素含量98.5％以上的洗脱液并进行合并，进行浓缩、干燥后得到高纯度的非达霉素成品。

【技术特征摘要】
1.一种快速色谱制备非达霉素的方法，其特征在于：包括如下具体操作步骤：(1)、将非达霉素发酵液进行固液分离得到菌丝体，然后加入60％～80％乙醇浸泡菌丝体并离心，得到非达霉素浸提液，待用；(2)、将步骤(1)所得的非达霉素浸提液用水稀释至乙醇浓度为10％～40％，之后导入聚苯乙烯树脂柱内进行吸附，然后采用乙醇进行梯度解吸，收集非达霉素含量45％以上的解吸液；(3)、将步骤(2)所收集的解吸液合并，并加水稀释至乙醇浓度为45％～55％，接着导入反相硅胶层析柱中，采用甲醇-水-乙酸进行梯度洗脱，收集非达霉素含量85％以上的洗脱液；(4)、将步骤(3)所收集到的洗脱液合并，并采用水稀释至甲醇浓度为55％～65％，再次导入反相硅胶层析柱中，采用乙腈-水-乙酸进行梯度洗脱，收集非达霉素含量98.5％以上的洗脱液并进行合并，进行浓缩、干燥后得到高纯度的非达霉素成品。2.根据权利要求1所述一种快速色谱...

【专利技术属性】
技术研发人员：江宏磊，连云阳，陈名洪，严凌斌，王传喜，彭飞，
申请(专利权)人：福建省微生物研究所，
类型：发明
国别省市：福建,35