一种药用级重组人激肽原酶产业化生产方法技术

本发明专利技术涉及一种表达重组人激肽原酶‑1的重组菌株及其发酵和纯化工艺，以及一种针对上述重组菌株优化的BSM发酵培养基。本发明专利技术的发酵工艺诱导剂甲醇的添加量较低，发酵液中目的蛋白产量高且易于纯化，获得的激肽原酶主要是低糖基化产物，免疫原性低并便于药物质量控制；与已有激肽原酶发酵技术相比，克服了发酵体系中甲醇加入量过大，制备的激肽原酶活性较低，糖基化修饰较高等缺陷。除此之外，与现有激肽原酶发酵技术相比，发酵时间明显缩短，有效降低了生产成本，活性、产量均有50％以上的提高。

Industrial production method of medicinal grade recombinant human kallikrein

The present invention relates to an expression and purification of recombinant human kallikrein 1 recombinant strain and its fermentation process, and a BSM for the fermentation of recombinant strain optimization of culture medium. Add the amount of fermentation process of the invention inducer of methanol is low, the protein in the fermentation liquid of high yield and easy purification, the kallikrein is mainly low glycosylation products, low immunogenicity and ease of drug quality control; compared with the existing fermentation technology of kallikrein, overcome the methanol fermentation system in addition amount is too large, the preparation of kallikrein activity lower, glycosylation higher defect. In addition, compared with the present fermentation technology, the fermentation time is shortened, the production cost is reduced effectively, and the activity and yield are increased by more than 50%.

【技术实现步骤摘要】
一种药用级重组人激肽原酶产业化生产方法
本专利技术属于微生物领域，涉及一种重组人激肽原酶-1(RecombinanthumanKallikrein-1，以下简称rhKLK1)基因的重组菌株及其生产和纯化工艺。
技术介绍
激肽释放酶－激肽系统(kallikreinkininsystem，KKS)又称激肽系统，广泛存在于动物体内的多个系统，尤其是在心血管系统内分布更为密集。其主要成分为：激肽原(活性因子前体)、激肽原酶(活性因子前体的激活物，又称为激肽释放酶)、激肽(主要活性因子)、激肽酶(活性因子的灭活物)。正常情况下激肽生成后迅速被循环中的激肽酶灭活。激肽原酶，又称激肽释放酶，是一种丝氨酸蛋白酶，能使激肽原释放出激肽，它具有很高的生理活性，在人体组织中起着十分重要的生理作用。目前分为两类：血浆激肽原酶(PK)和组织激肽原酶(TK)。两种酶在分子量大小、底物特异性、免疫学特征和释放出的激肽方面都不同。血浆激肽原酶参与血凝块的表面激活、纤维蛋白溶解、激肽生成和炎症过程。组织激肽原酶广泛存在于肾、胰腺、胃肠道黏膜及中枢神经系统等许多组织中，它以激肽原酶原的形式在组织中合成，再经胰蛋白酶激活形成组织激肽原酶，并可释放至血液循环。组织激肽原酶基因是一类大的多基因家族，目前证明人组织激肽原酶基因家族至少由15个基因(KLK1-KLK15)组成。共分为五个亚系：第一组KLK4、KLK5、KLK14；第二组KLK9、KLK11、KLK15；第三组KLK10、KLK12；第四组KLK6、KLK13；最后一组KLK8和KLK1、KLK2、KLK3。而这15个基因中迄今为止只有KLKl、KLK2和KLK3具有特异性生物学功能，与疾病的研究较为深刻，其他基因的研究报道极少。KLK1主要是通过低分子激肽原释放赖氨酰缓激肽即胰激肽原发挥其生物学功能。然而，KLK1不同的表达形式提示在不同类型细胞中该酶表现不同的专一性。KLK1除发挥其激肽原酶功能外，根据它在垂体和胰腺等组织的存在表明它能对肽类激素和生长素进行加工处理。KLK1能降解胰岛素原、LDL、心房尿钠素前体、凝乳酶原、血管肠肽、前胶元酶、血管紧张素原等。在每一类型细胞中KLK1都可能有单一的或多重的或常见的或独特的功能。但是，研究表明激肽释放才是最主要的生理功能，起到扩张毛细血管，改善微循环的作用，产生舒张毛细血管和扩张小动脉等药理作用。KLK2，KLK3和KLK1的天然底物不同，与KLK1相比，具有非常低的活性，而其他激肽原酶有的与生理过程有关，有的与疾病的病理过程有关，但无一具有特异性基质水解作用。激肽原酶KLK1临床用于糖尿病并发症、高血压及急性缺血性脑卒中等疾病的治疗。较为常见的产品主要有两类：一类是从猪胰脏提取的激肽原酶(例如常州千红制药的“怡开”)，另一类是人尿激肽原酶(例如广州天普的“尤瑞克林”)，其主要由人尿中提取，上述产品均存在来源有限，生产工艺难以稳定可控，病毒污染风险，从而导致最终产品生产工艺复杂，批次生产一致性较差，成本较高。迄今为止，国内外采用基因工程的方法利用酵母表达系统生产重组人激肽原酶(rhKLK1)蛋白进行了不少研究，但由于种属差异，rhKLK1天然序列很难直接在酵母中表达，表达产物常出现序列不正确、糖基化修饰均一度差、生物活性低、产量低或生产工艺复杂、难以产业化应用等问题。例如，1998年Chan等得到的rhKLK1蛋白电泳时明显有差不多的两条带，且无法证明产品均一性(ProteinExpressionandPurification12,361–370，1998)。另外根据中国专利申请200610027754.1可知，2006年上海万兴生物研发的毕赤酵母表达rhKLK1蛋白工艺，宿主內源蛋白表达量高，rhKLK1分离纯化困难；而且，同样的通过其专利中的文字描述，以及申请人后期对其工艺的验证，发现所表达产物为高低糖基化修饰激肽原酶在蛋白电泳时显示仍然有相差无几的两条带产生。为了在一定程度上克服上述问题，申请人在先申请201310737079.1中，虽然对其编码基因进行了优化，使其更适合于毕赤酵母表达系统表达，虽然表达量有所上升，但所表达的产物仍然存在有高低不同分子量的两个蛋白，且表达量也是接近的。根据已有文献分析可知，之所以有这两个高低分子量的rhKLK1蛋白产生，主要是因为糖基化修饰的不同，并且毕赤酵母表达的高糖基化rhKLK1具有高甘露糖型结构，这种糖链结构不仅能改变重组糖蛋白的功能和特点，而且高甘露糖型糖链在人体内可以与甘露糖受体结合，导致药动学性质不良和产生免疫反应，而低糖基化rhKLK1具有低甘露糖型结构，可以很好的克服上述毕赤酵母表达rhKLK1的缺点。而且，若能将所表达的rhKLK1较集中于低糖基化部分，不仅对后续的纯化工艺，同时对工业化生产时的质量控制都无疑有较大的帮助。
技术实现思路
为克服上述技术问题，专利技术人在没有现有技术能给出成功预期的情况下，经过长期的实验摸索，在组合多样的发酵控制参数和纯化工艺中，摸索出了最佳的发酵工艺，不仅是采用优化过的无机培养基，在提高产量和活性的同时使得生产成本大大降低，而且可以使获得的产物均以低糖基化条带为主，为工业化生产时的质量控制提供了有效支持。同时，本专利技术提供的一种重组毕赤酵母高效发酵制备激肽原酶的生产工艺，也克服了现有激肽原酶发酵制备技术中存在的甲醇加入量过大，激肽释放原酶活性较低，糖基化修饰较高的不足。本专利技术的第一个目的，是提供一种rhKLK1的毕赤酵母发酵方法，其发酵过程中：诱导阶段的甲醇流加速度为：5～11mL/h-1L-1，诱导温度为：25～28℃，所用BSM发酵培养基各组成成分及其配比分别为：K2SO43.64～14.56g/L，MgSO45.96～11.92g/L，KOH0.372～0.744g/L，CaSO41.652～3.304g/L，H3PO410.68～21.36mL/L，甘油16～32g/L。优选的，所述毕赤酵母表达方法，其中菌体增殖阶段、限速生长阶段以及rhKLK1诱导表达阶段中的培养基均采用上述所述BSM发酵培养基。作为优选的，所述方法包含下述步骤：步骤1)将rhKLK1毕赤酵母工程菌株划线YPD平板，30℃培养3-5天。步骤2)将此复苏后的rhKLK1工程菌株单克隆接种于YPD液体培养基30℃培养至OD600＝6～8，即得到上罐种子液。步骤3)将此种子液接种于发酵罐的BSM发酵培养基中，发酵40～72h即得到rhKLK1发酵液，其中诱导阶段的甲醇流加速度：5～11mL/h-1L-1，诱导温度为：25～28℃，所述BSM发酵培养基各组成成分及其配比分别为：K2SO43.64～14.56g/L，MgSO45.96～11.92g/L，KOH0.372～0.744g/L，CaSO41.652～3.304g/L，H3PO410.68～21.36mL/L，甘油16～32g/L。更优选的，上述步骤3)中增殖阶段发酵温度为30℃，pH＝6.0±0.2，转速＝300rpm培养，DO值100％，添加PTM1(2ml/L)，发酵20h；限速生长阶段，先以30ml/h-1L-1的速率补加50％甘油，2h，然后以60ml/h-1L-1的速率补加50％甘油，4h；诱导阶段，调本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种rhKLK1的毕赤酵母高密度发酵方法，其特征在于：其发酵过程中：诱导阶段的甲醇流加速度为：5～11mL/h

【技术特征摘要】
2015.12.31 CN 20151103319311.一种rhKLK1的毕赤酵母高密度发酵方法，其特征在于：其发酵过程中：诱导阶段的甲醇流加速度为：5～11mL/h-1L-1，诱导温度为：25～28℃，所用BSM发酵培养基各组成成分及其配比分别为：K2SO43.64～14.56g/L，MgSO45.96～11.92g/L，KOH0.372～0.744g/L，CaSO41.652～3.304g/L，H3PO410.68～21.36mL/L，甘油16～32g/L。2.如权利要求1所述的发酵方法，其特征在于：所述方法包含下述步骤：步骤1)将rhKLK1毕赤酵母工程菌株划线YPD平板，30℃培养3-5天；步骤2)将此复苏后的rhKLK1工程菌株单克隆接种于YPD液体培养基30℃培养至OD600＝6～8，即得到上罐种子液；步骤3)将此种子液接种于发酵罐的BSM发酵培养基中，发酵40～72h即得到rhKLK1发酵液，其中诱导阶段的甲醇流加速度：5～11mL/h-1L-1，诱导温度为：25～28℃，所述BSM发酵培养基各组成成分及其配比分别为：K2SO43.64～14.56g/L，MgSO45.96～11.92g/L，KOH0.372～0.744g/L，CaSO41.652～3.304g/L，H3PO410.68～21.36mL/L，甘油16～32g/L。3.如权利要求2所述的发酵方法，其特征在于：上述步骤3)中增殖阶段发酵温度为30℃，pH＝6.0±0.2，转速＝300rpm培养，DO值100％，添加PTM1(2mL/L)，发酵20h；限速生长阶段，先以30ml/h-1L-1的速率补加50％甘油，2h，然后以60mL/h-1L-1的速率补加50％甘油，4h；诱导阶段，调...

【专利技术属性】
技术研发人员：马永，王安良，范宇，
申请(专利权)人：江苏众红生物工程创药研究院有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32