The present invention relates to the field of genetic engineering recombinant protein of a supercritical fluid chromatography separation and purification technology of enterokinase, comprising the following steps: (1) gene EKL in bovine enterokinase catalytic subunit to construct the mutant EKLM, EKLM mutant nucleotide sequence as shown in SEQIDNO.1; (2) replace the existing mutants in EKLM negative expression of Escherichia coli codon to obtain EKLMO gene sequence optimization, the nucleotide sequence of EKLMO as shown in SEQIDNO.2. By using the method of the invention for producing recombinant bovine enterokinase catalytic subunit protein, can effectively maintain bovine enterokinase catalytic subunit activity, high protein yield, and the method of the invention has the advantages of simple production process, stable product quality. The purified protein can be used for many purposes, such as bioengineering or drug production, and has remarkable application value.
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因工程领域的一种超临界流体色谱分离纯化肠激酶工艺。
技术介绍
肠激酶(Enterokinase,简写为EK)是存在于哺乳动物十二指肠内的一种异源二聚体丝氨酸蛋白酶。其天然蛋白分子量为150kDa,由一条115kDa的重链和一条35kDa的轻链组成,在pH值4.5-9.5和温度4-45OC之间均可以特异性的水解蛋白底物。肠激酶识别底物蛋白的序列为DDDDK,它可以在赖氨酸残基的C端进行切割。这样的酶切优势使其成为了融合蛋白表达体系中理想的工具酶。天然提取的肠激酶很容易混有其它种类蛋白酶,限制了其在基因工程中的广泛应用。因此利用基因工程重组制备肠激酶逐渐成为大家选择的方向。肠激酶由一条重链和一条轻链组成,重链又称结构亚基,轻链又称催化亚基,二者通过分子间二硫键结合。结构亚基负责将肠激酶定位到小肠的刷状缘膜上,催化亚基行使催化活性,将胰蛋白酶原激活成为胰蛋白酶。为了高效获得制备肠激酶催化亚基蛋白,有必要开发基因工程重组肠激酶催化亚基。
技术实现思路
本专利技术为了解决然提取的肠激酶很容易混有其它种类蛋白酶,限制了其在基因工程中的广泛应用,提供了一种超临界流体色谱分离纯化肠激酶工艺。本专利技术是通过以下技术方案实现的:一种超临界流体色谱分离纯化肠激酶工艺,其特征在于:其步骤为:⑴在牛肠激酶催化亚基的基因EKL上构建突变体EKLM,突变体EKLM的核苷酸序列;⑵替换掉突变体EKLM中存在的大肠杆菌不利表达的密码子从而获得优化的基因序列,EKLMO,EKLMO的核苷酸序列。⑶在EKLMO的5`末端加入牛肠激酶自身的酶切位点序列,在EKLMO的3`末端加入 ...
【技术保护点】
一种超临界流体色谱分离纯化肠激酶工艺,其特征在于:工艺步骤为 :⑴在牛肠激酶催化亚基的基因 EKL 上构建突变体 EKLM,突变体 EKLM 的核苷酸序列;⑵替换掉突变体 EKLM 中存在的大肠杆菌不利表达的密码子从而获得优化的基因序列,EKLMO,EKLMO 的核苷酸序列;⑶在 EKLMO 的 5` 末端加入牛肠激酶自身的酶切位点序列,在 EKLMO 的 3` 末端加入标 签序列,得到完整的表达基因片段;⑷将上述表达基因片段克隆进入载体,构建得到高效表达载体,将其转入大肠杆菌 BL21,用 IPTG 诱导重组基因的表达 ;⑸收集菌体,提纯目的蛋白。
【技术特征摘要】
1.一种超临界流体色谱分离纯化肠激酶工艺,其特征在于:工艺步骤为:⑴在牛肠激酶催化亚基的基因EKL上构建突变体EKLM,突变体EKLM的核苷酸序列;⑵替换掉突变体EKLM中存在的大肠杆菌不利表达的密码子从而获得优化的基因序列,EKLMO,EKLMO的核苷酸序列;⑶在EKLMO的5`末端加入牛肠激酶自身的酶切位点序列,在EKLMO的3`末端加入标签序列,得到完整的表达基因片段;⑷将上述表达基因片段克隆进入载体,构建得到高效表达载体,将其转入大肠杆菌BL21,用IPTG诱导重组基因的表达;⑸收集菌体,提纯目的蛋白。2.根据权利要求1所述的超临界流体色谱分离纯化肠激酶工艺,其特征在于:所述步骤⑶中标签序列为四个连续的组氨酸标签序列HIS4。3.根据权利要求1或2所述的超临界流体色谱分离纯化肠激酶工艺,其特征在于:所述步骤⑸中提纯目的蛋白采用的是包涵体变复性方法。4.根据权利要求3所述的超临界流体色谱分离纯化肠激酶工艺,其特征在于:所述包涵体变复性方法的步骤为:①按照每10g菌体加入30ml比例加入到溶液A中重悬,破碎...
【专利技术属性】
技术研发人员:费苹,陈银芳,费正明,陈明全,
申请(专利权)人:如皋市永兴肠衣有限公司,
类型:发明
国别省市:江苏;32
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