兼具谷胱甘肽过氧化物酶和超氧化物歧化酶活性的双功能抗氧化酶及其制备方法技术

一种兼具谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)和超氧化物歧化酶(SOD)活性的双功能抗氧化酶及其制备方法，属于生物技术领域。涉及序列SEQ ID No:1～26，其由GPX和SOD两种酶的氨基酸序列组成，既能分解SOD的底物，又能分解GPX的底物。先用基因合成法获得杂合tRNA基因，再合成或扩增GPX和SOD基因，将两者组装到同一个能够表达杂合tRNA的分泌型原核表达载体上，转化TAG工程菌，在亚硒酸钠存在下诱导表达，通过常规氨基酸进入肽链的方式将GPX的催化基团Sec引入到蛋白的底物结合部位，赋予其高的GPX和SOD活性。本发明专利技术方法简单，酶蛋白活力和产量高、稳定性好，具有高效的抗氧化功能。

Dual function antioxidant enzyme with glutathione peroxidase and superoxide dismutase activity and preparation method thereof

The invention relates to a bifunctional antioxidant enzyme with the activity of glutathione peroxidase (GPX) and superoxide dismutase (SOD) and a preparation method thereof, belonging to the field of biotechnology. The sequence of SEQ ID relates to No:1 ~ 26, the amino acid sequence of GPX and SOD two kinds of enzyme which can decompose SOD substrate, and the substrate of GPX decomposition. First use the gene synthesis method to obtain heterozygous tRNA gene, and then synthesized or amplified GPX and SOD genes, which are assembled to a same expression of heterozygous tRNA secreting prokaryotic expression vector, transformation of TAG engineering bacteria induced expression in the presence of sodium selenite, into conventional amino acid chains through the way of Sec the catalytic group GPX into protein substrate binding site, given its high GPX and SOD activity. The method has the advantages of simple method, high activity and output of enzyme protein, good stability and high antioxidant function.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物
，具体涉及一种兼具谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)和超氧化物歧化酶(SOD)活性的双功能抗氧化酶及其制备方法。
技术介绍
活性氧(ROS)是机体氧代谢的副产物，正常生理状态下，ROS的产生和消除处于动态平衡状态，从而维持机体氧化和抗氧化的相对平衡。然而，随着生态恶化、环境污染及现代化生活不规律的程度日趋加深，多种内在及外在因素导致ROS的过量产生，当过多的ROS不能及时清除，与之相伴的疾病也愈加严重和高发，对人类的健康造成严重威胁。机体针对活性氧的酶学防御系统主要包括超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)和谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)。GPX在该体系中发挥着重要的作用，它以底物GSH为还原剂，分解体内的过氧化氢和各类氢过氧化物，因而能清除体内多种活性氧(ROS)，防止脂质过氧化，治疗由活性氧引起的各种疾病，如衰老、紫外线辐射、心脑血管疾病、白内障、肿瘤等。与其它抗氧化酶不同，GPX除了能清除ROS外，还能降解脂质过氧化物，防止细胞过氧化损伤，这种独特的保护细胞的功能使它在抗氧化酶体系中占有特别重要的位置。然而，由于天然GPX的催化基团是硒代半胱氨酸(SeCys)，而且来源有限、稳定性差，致使它的人工产物及其模拟物的研究备受关注。SOD是超氧阴离子(O2·-)的唯一清除剂，能转化O2·-为过氧化氢(H2O2)，继而被CAT、GPX等将其分解为水(H2O)，从而使有害的O2·-和H2O2转化为无害的水分子。如果抗氧化酶的协同作用被破坏，可将ROS的损伤效应放大，从而引发多种疾病。根据这些酶在清除ROS时的协同作用，获得兼具GPX和SOD两种抗氧化功能于一体的双功能抗氧化酶，相比单一抗氧化酶，更有利于清除活性氧，发挥其巨大的应用价值。中国专利201110287018.0公开的方法是制备一种兼具SOD和GPX活性的65肽，是将SOD和GPX活性中心的结构域整合而形成的小分子双功能模拟酶，正象其说明书中显示的那样，其GPX活力831U/umol远低于天然GPX57801U/umol的活力。中国专利201310302778.3、201310142866.1和201510431360.1公开的方法在活力上取得了突破性进展，但其只能用于制备高活力的各型单功能GPX及其突变体，不包括双功能抗氧化酶及其制备方法。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种兼具谷胱甘肽过氧化物酶和超氧化物歧化酶活性的双功能抗氧化酶的氨基酸序列并用中国专利201510431360.1公开的人工合成的能通读UAG为硒代半胱氨酸的杂合tRNA和特殊的工程菌制备该双功能抗氧化酶。本专利技术涉及序列SEQIDNo:1～26，其由GPX和SOD两种酶的氨基酸序列组成，既能分解SOD的底物，又能分解GPX的底物。先用基因合成法获得杂合tRNA基因，再合成或扩增GPX和SOD基因，将两者组装到同一个能够表达杂合tRNA的分泌型原核表达载体上，转化TAG工程菌，在亚硒酸钠存在下诱导表达，通过常规氨基酸进入肽链的方式将GPX的催化基团Sec引入到蛋白的底物结合部位，赋予其高的GPX和SOD活性。本专利技术方法简单，酶蛋白活力和产量高、稳定性好，具有高效的抗氧化功能。本专利技术应用基因工程技术、原核细胞培养技术，以基因组中所有UAG终止密码子被UAA终止密码子替代及删除释放因子RF1的大肠杆菌为表达系统，利用人工合成的杂合tRNA编码UAG终止密码子为硒代半胱氨酸(硒代半胱氨酸)，从而通过常规氨基酸进入肽链的方式实现硒代半胱氨酸在谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)的活性中心定点插入和高活力兼具GPX和SOD活性的双功能抗氧化酶的高效表达。本方法可以在避开原核生物编码硒代半胱氨酸的复杂机制及低效率等缺点，发挥原核生物便于基因操作、高效表达外源基因和培养成本低等优点，为兼具GPX和SOD活性的双功能酶等具有药用价值的硒蛋白提供简单、高效的制备方法。本专利技术方法在日化品生产和生物制药方面具有广阔的应用前景。本专利技术使用中国专利201510431360.1公开的杂合tRNA作为搬运RNA，制备高活力兼具GPX和SOD活性的双功能抗氧化酶。这些杂合tRNA是以大肠杆菌丝氨酸的tRNA的编码序列serT(参见NCBI，GeneID:944826，编码tRNAserUGA)和硒代半胱氨酸的tRNA编码序列SelC(参见NCBI，GeneID:948167，编码tRNAsec)为模板，通过计算机辅助的序列分析和基因合成，得到一种能够编码琥珀型终止密码子UAG为硒代半胱氨酸的杂合tRNAUACUA，其由90个碱基组成，与大肠杆菌tRNAsec相比较，其既能够作为硒代半胱氨酸合成的底物tRNA，又能够被大肠杆菌自身的延伸因子EF-Tu识别，从而通过常规氨基酸进入肽链的方式实现硒代半胱氨酸在UAG密码子处的定点编码与插入。利用此杂合tRNA在UAG通读表达系统中能高效表达高活力兼具GPX和SOD活性的双功能抗氧化酶，所述的杂合tRNAUACUA的一级核苷酸序列如SEQIDNo：1所示：进一步，所述的杂合tRNA的具体核苷酸序列还包括将序列1(SEQIDNo：1)第72位碱基A突变为其它三种碱基C、U、G中的任何一个所形成的新型杂合tRNA，其序列如SEQIDNo：2、SEQIDNo：3、SEQIDNo：4所示。进一步，所述的杂合tRNA的具体碱基序列还包括，将序列1-4(SEQIDNo：1、SEQIDNo：2、SEQIDNo：3、SEQIDNo：4)中第8位碱基G突变为C、第79位碱基C突变为G所形成的任何一种新型杂合tRNA，其序列如SEQIDNo：5、SEQIDNo：6、SEQIDNo：7、SEQIDNo：8所示。进一步，所述的杂合tRNA的具体碱基序列还包括，将序列1-8(SEQIDNo：1、SEQIDNo：2、SEQIDNo：3、SEQIDNo：4、SEQIDNo：5、SEQIDNo：6、SEQIDNo：7、SEQIDNo：8)中第62位碱基G突变为U、第78位碱基U突变为A和第64位碱基A突变为C、第76位碱基U突变为G所形成的任何一种新型杂合tRNA，其序列如SEQIDNo：9、SEQIDNo：10、SEQIDNo：11、SEQIDNo：12、SEQIDNo：13、SEQIDNo：14、SEQIDNo：15、SEQIDNo：16所示。本专利技术所述的兼具GPX和SOD活性的双功能抗氧化酶是将GPX和SOD的氨基酸序列中间插入一段特殊的连接短肽而形成的具有新的氨基酸序列与组成的新型抗氧化酶GPX-L-SOD，其氨基酸序列如SEQIDNo：17所示(实施例1-17)。进一步，所述的兼具GPX和SOD活性的双功能抗氧化酶的具体氨基酸序列还包括，将SEQIDNo：17中SOD的氨基酸序列提前，而GPX的氨基酸序列移到连接肽之后所形成的SOD-L-GPX，其氨基酸序列如SEQIDNo：18所示(实施例18)。进一步，所述的兼具GPX和SOD活性的双功能抗氧化酶的具体氨基酸序列还包括，将SEQIDNo：17中第204-229位氨基酸中的任何一个或几个去掉或替换后所形成的新氨基酸序列。比如将第229位氨基酸去掉所形成的新序列如SEQIDNo：19所示(实施例19)。进一步本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种兼具谷胱甘肽过氧化物酶和超氧化物歧化酶活性的双功能抗氧化酶，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ ID No：17、SEQ ID No：18、SEQ ID No：19、SEQ ID No：20、SEQ ID No：21、SEQ ID No：22、SEQ ID No：23、SEQ ID No：24、SEQ ID No：25或SEQ ID No：26所示。

【技术特征摘要】
1.一种兼具谷胱甘肽过氧化物酶和超氧化物歧化酶活性的双功能抗氧化酶，其特征在于：其氨基酸序列如SEQIDNo：17、SEQIDNo：18、SEQIDNo：19、SEQIDNo：20、SEQIDNo：21、SEQIDNo：22、SEQIDNo：23、SEQIDNo：24、SEQIDNo：25或SEQIDNo：26所示。2.权利要求1所述的一种兼具谷胱甘肽过氧化物酶和超氧化物歧化酶活性的双功能抗氧化酶的制备方法，其步骤如下：1)、载体的构建：根据中国专利201510431360.1公开的杂合tRNA的碱基序列SEQIDNo：1、SEQIDNo：2、SEQIDNo：3、SEQIDNo：4、SEQIDNo：5、SEQIDNo：6、SEQIDNo：7、SEQIDNo：8、SEQIDNo：9、SEQIDNo：10、SEQIDNo：11、SEQIDNo：12、SEQIDNo：13、SEQIDNo：14、SEQIDNo：15或SEQIDNo：16，在生物公司用DNA合成仪人工合成对应的编码基因，确保杂合tRNA基因的5′端含有lpp启动子序列和特定的酶切位点，3′端含有rrnc终止子序列和特定酶切位点；用相同的限制性核酸内切酶切割两端含特定酶切位点的杂合tRNA基因和用来表达该杂合tRNA的分泌型原核表达载体，再用DNA连接酶通过特定的酶切位点将杂合tRNA基因组装到分泌型原核表达载体的多克隆位点以外，得到含有杂合tRNA的分泌型原核表达载体；所述的特定的酶切位点可以是表达载体的多克隆位点以外序列含有的而杂合tRNA基因中不存在的任何一个酶切位点，是载体上固有的由限制性核酸内切酶识别的碱基组成的DNA序列；目的基因序列是将氨基酸序列如SEQIDNo：17、SEQIDNo：18、SEQIDNo：19、SEQIDNo：20、SEQIDNo：21或SEQIDNo：22、SEQIDNo：23、SEQIDNo：24、SEQIDNo：25、SEQIDNo：26所示的GPX-L-SOD或SOD-L-GPX基因中硒代半胱氨酸的编码序列替换为琥珀型终止密码子TAG后的基因，在生物公司用DNA合成仪人工合成该目的基因序列对应的编码基因，确保两端都含有特定的酶切位点；用相同的限制性核酸内切酶切割两端含特定酶切位点的GPX-L-SOD或SOD-L-GPX基因和上步获得的含有杂合tRNA的分泌型原核表达载体，再用DNA连接酶通过特定的酶切位点将GPX-L-SOD或SOD-L-GPX基因组装到该分泌型原核表达载体的多克隆位点上；所述的特定的酶切位点可以是表达载体的多克隆位点中含有的而GPX-L-SOD或SOD-L-GPX基因中不存在的任何一个酶切位点，是载体上固有的由限制性核酸内切酶识别的碱基组成的DNA序列；2)、阳性转化子的筛选及蛋白的表达与纯化：用步骤1)中构建的含有杂合tRNA基因的和编码序列中含TAG的目的基因的表达载体转化UAG通读工程菌-C321.ΔA.exp的感受态细胞，涂含氨苄抗性的营养琼脂平板，筛选阳性菌株；将阳性转化子扩大培养后，在含有亚硒酸钠的营养琼脂培养基中，经IPTG低温4～25℃诱导表达，在杂合tRNA的识别下，将UAG编码为硒代半胱氨酸，直接表达出在底物GSH的结合部位含有硒代半胱氨酸的GPX-L-SOD或SOD-L-GPX，酶蛋白以可溶性形式表达并分泌到菌体的周质腔里；抗性筛选获得的菌株经37℃扩大培养后，转至4～25℃诱导表达；收集、洗涤、冰浴下超声破碎菌体、释放酶蛋白，将液体低温离心，去除菌体沉淀、获得上清液；用谷胱甘肽(GSH)亲和层析纯化GPX-L-SOD或SOD-L-GPX蛋白，透析冻干后即得到高活力兼具谷胱甘肽过氧化物酶和超氧化物歧化酶活性的双功能抗氧化酶GPX-L-SOD或SOD-L-GPX蛋白纯品。3.权利要求1所述的一种兼具谷胱甘肽过氧化物酶和超氧化物歧化酶活性的双功能抗氧化酶的制备方法，其步骤如下：1)、表达载体的构建：根据中国专利201510431360.1公开的杂合tRNA的碱基序列SEQIDNo：1、SEQIDNo：2、SEQIDNo：3、SEQIDNo：4、SEQIDNo：5、SEQIDNo：6、SEQIDNo：7、SEQIDNo：8、SEQ...

【专利技术属性】
技术研发人员：魏景艳，管徒晨，宋健，吕秀秀，
申请(专利权)人：吉林大学，
类型：发明
国别省市：吉林;22