用于分离获得肺脏干细胞的试剂盒及方法技术

本发明专利技术公开了用于分离获得肺脏干细胞的试剂盒及方法，其中肺脏干细胞分离试剂盒包含：组织消化液；经过辐照处理的胚胎成纤维细胞；以及肺脏干细胞分离培养液。利用该试剂盒能够有效获得可以大量扩增的肺脏干细胞，且获得的肺脏干细胞活性好、纯度高、无细菌和支原体污染。

Kits and methods for isolation of lung stem cells

The invention discloses a kit and a method for isolated lung stem cells, including lung stem cell separation reagent kit contains: digested tissue; irradiated embryos fibroblasts; and lung stem cells culture fluid. The lung stem cells can be effectively amplified by using the kit, and the obtained lung stem cells have good activity, high purity, no bacteria and Mycoplasma contamination.

【技术实现步骤摘要】
用于分离获得肺脏干细胞的试剂盒及方法
本专利技术涉及肺脏干细胞分离和移植
，具体涉及用于分离获得肺脏干细胞的试剂盒及方法。
技术介绍
随着空气污染的增加及病毒感染等其他一些因素，肺部的一些疾病如肺纤维化，慢性阻塞性肺病等越来越多的影响了人类的健康，甚至生存。对于这些疾病的治疗，目前最有效的治疗方法是肺脏移植。但是由于可用的供体有限，异体之间的免疫排斥等现实原因，能够接受肺脏移植治疗的病人数量非常稀少。除去肺脏移植，目前还没有有效的治疗手段。肺脏干细胞属于成体干细胞，在机体内分布广泛，其在细胞移植治疗中具有器官的靶向性，再生能力强，无成瘤性，可用于自体干细胞移植治疗，免疫排斥的风险小，具有很强的可操作性。并且，目前已有研究发现，将远端气管中的肺脏干细胞分离出来，然后在体外大量扩增后移植到免疫缺陷的肺部损伤的小鼠中，移植的肺脏干细胞能够整合到小鼠肺脏中并在损伤部位形成肺泡样的结构。因而，干细胞移植在治疗肺部损伤疾病方面具有非常广阔的前景。但是，长期以来由于技术的限制，很难从成体的组织和器官中分离获得可以大量扩增的肺脏干细胞。因而，目前的肺脏干细胞分离获得方法仍有待改进。
技术实现思路
本专利技术旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本专利技术的一个目的在于提出一种能够有效从成体的组织和器官中分离获得可以大量扩增的肺脏干细胞的手段。在本专利技术的第一方面，本专利技术提供了一种肺脏干细胞分离试剂盒。根据本专利技术的实施例，该试剂盒包含：组织消化液；经过辐照处理的胚胎成纤维细胞；以及肺脏干细胞分离培养液，其中，所述组织消化液包含：99体积％的PBS；0.1-2U/mlDNA酶；0.1-0.2mg/mlI型胶原酶；0.1-0.2mg/mlIV型胶原酶；0.04-0.1mg/ml分散酶；0.1-0.5mg/ml蛋白酶XIV；0.1-3mg/ml链丝菌蛋白酶E；以及0.2-0.5mg/ml胰酶，所述肺脏干细胞分离培养液包含：90体积％的RPMI1640培养基；10体积％的胎牛血清；1-3mmol/LL-谷氨酰胺；0.05-0.15mmol/Lβ-巯基乙醇；100-1000U/ml白血病抑制因子；以及2-5ng/mlEGF生长因子。专利技术人惊奇地发现，本专利技术的试剂盒能够有效用于肺脏干细胞分离，具体地，利用其组织消化液能够有效对包含肺脏干细胞的生物样本进行消化处理，获得单细胞；利用肺脏干细胞分离培养液与单细胞混合，并置于经过辐照处理的胚胎成纤维细胞上进行孵育培养，能够有效获得可以大量扩增的肺脏干细胞，且获得的肺脏干细胞活性好、纯度高、无细菌和支原体污染。此外，本专利技术的试剂盒成本低，使用方便，易于大量生产利用，并且尤其适用于从微量生物样本中分离获得肺脏干细胞。根据本专利技术的实施例，通过下列任意一种方法制备获得所述经过增殖抑制处理的胚胎成纤维细胞：(1)将胚胎成纤维细胞进行辐照量为30-80Gy的辐照处理1-5小时；(2)将所述胚胎成纤维细胞进行1-30ug/ml丝裂霉素C处理1-5小时。由此，经过增殖抑制处理的胚胎成纤维细胞失去细胞生长活性，有利于对肺脏干细胞进行孵育培养。根据本专利技术的实施例，所述胚胎成纤维细胞来源于小鼠，优选E13.5小鼠，根据本专利技术的实施例，所述辐照处理是利用细胞辐照仪进行的。由此，辐照效果好，经过辐照处理的胚胎成纤维细胞失去细胞生长活性，但仍能用于对肺脏干细胞进行孵育培养。根据本专利技术的实施例，所述组织消化液包含：99体积％的PBS；1U/mlDNA酶；0.15mg/mlI型胶原酶；0.15mg/mlIV型胶原酶；0.07mg/ml分散酶；0.3mg/ml蛋白酶XIV；2mg/ml链丝菌蛋白酶E；以及0.35mg/ml胰酶，所述肺脏干细胞分离培养液包含：90体积％的RPMI1640培养基；10体积％的胎牛血清；2mmol/LL-谷氨酰胺；0.1mmol/Lβ-巯基乙醇；500U/ml白血病抑制因子；以及3.5ng/mlEGF生长因子。由此，利用该组织消化液对包含肺脏干细胞的生物样本进行消化处理时效果好，能够有效获得单细胞，且对其细胞活性无损伤；而该肺脏干细胞分离培养液能够有效用于肺脏干细胞的孵育培养，从而能够有效获得可以大量扩增的肺脏干细胞，且获得的肺脏干细胞纯度高、无细菌和支原体污染。在本专利技术的第二方面，本专利技术还提供了一种分离获得肺脏干细胞的方法。根据本专利技术的实施例，该方法包括以下步骤：利用组织消化液将包含肺脏干细胞的生物样本进行消化处理，以便获得单细胞；以及将所述单细胞与肺脏干细胞分离培养液混合，并置于经过辐照处理的胚胎成纤维细胞上进行孵育培养，以便获得肺脏干细胞，其中，所述组织消化液包含：99体积％的PBS；0.1-2U/mlDNA酶；0.1-0.2mg/mlI型胶原酶；0.1-0.2mg/mlIV型胶原酶；0.04-0.1mg/ml分散酶；0.1-0.5mg/ml蛋白酶XIV；0.1-3mg/ml链丝菌蛋白酶E；以及0.2-0.5mg/ml胰酶，所述肺脏干细胞分离培养液包含：90体积％的RPMI1640培养基；10体积％的胎牛血清；1-3mmol/LL-谷氨酰胺；0.05-0.15mmol/Lβ-巯基乙醇；100-1000U/ml白血病抑制因子；以及2-5ng/mlEGF生长因子。专利技术人惊奇地发现，利用本专利技术的方法能够有效获得可以大量扩增的肺脏干细胞，且获得的肺脏干细胞活性好、纯度高、无细菌和支原体污染，尤其适用于从微量生物样本中分离获得肺脏干细胞，并且，该方法操作简单、实施成本低，易于推广。根据本专利技术的实施例，所述组织消化液包含：99体积％的PBS；1U/mlDNA酶；0.15mg/mlI型胶原酶；0.15mg/mlIV型胶原酶；0.07mg/ml分散酶；0.3mg/ml蛋白酶XIV；2mg/ml链丝菌蛋白酶E；以及0.35mg/ml胰酶。由此，对包含肺脏干细胞的生物样本进行消化处理的效果好，能够有效获得单细胞，且对其细胞活性无损伤。根据本专利技术的实施例，所述肺脏干细胞分离培养液包含：90体积％的RPMI1640培养基；10体积％的胎牛血清；2mmol/LL-谷氨酰胺；0.1mmol/Lβ-巯基乙醇；500U/ml白血病抑制因子；以及3.5ng/mlEGF生长因子。由此，该肺脏干细胞分离培养液能够有效用于肺脏干细胞的孵育培养，从而能够有效获得可以大量扩增的肺脏干细胞，且获得的肺脏干细胞活性好、纯度高、无细菌和支原体污染。根据本专利技术的实施例，通过下列任意一种方法制备获得所述经过增殖抑制处理的胚胎成纤维细胞：(1)将胚胎成纤维细胞进行辐照量为30-80Gy的辐照处理1-5小时；(2)将所述胚胎成纤维细胞进行1-30ug/ml丝裂霉素C处理1-5小时。由此，经过增殖抑制处理的胚胎成纤维细胞失去细胞生长活性，有利于对肺脏干细胞进行孵育培养。根据本专利技术的实施例，所述胚胎成纤维细胞来源于小鼠，优选E13.5小鼠。根据本专利技术的实施例，所述辐照处理是利用细胞辐照仪进行的。由此，所述经过辐照处理的胚胎成纤维细胞失去细胞生长活性，有利于对肺脏干细胞进行孵育培养。根据本专利技术的实施例，于36-38摄氏度，优选37摄氏度的条件下进行所述消化处理1-5小时。由此，消化处理效果好，能够有效获得单细胞，且对其细胞活性无损伤。根据本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种肺脏干细胞分离试剂盒，其特征在于，包含：组织消化液；经过增殖抑制处理的胚胎成纤维细胞；以及肺脏干细胞分离培养液，其中，所述组织消化液包含：99体积％的PBS；0.1‑2U/ml DNA酶；0.1‑0.2mg/ml I型胶原酶；0.1‑0.2mg/ml IV型胶原酶；0.04‑0.1mg/ml分散酶；0.1‑0.5mg/ml蛋白酶XIV；0.1‑3mg/ml链丝菌蛋白酶E；以及0.2‑0.5mg/ml胰酶，所述肺脏干细胞分离培养液包含：90体积％的RPMI1640培养基；10体积％的胎牛血清；1‑3mmol/LL‑谷氨酰胺；0.05‑0.15mmol/Lβ‑巯基乙醇；100‑1000U/ml白血病抑制因子；以及2‑5ng/ml EGF生长因子。

【技术特征摘要】
1.一种肺脏干细胞分离试剂盒，其特征在于，包含：组织消化液；经过增殖抑制处理的胚胎成纤维细胞；以及肺脏干细胞分离培养液，其中，所述组织消化液包含：99体积％的PBS；0.1-2U/mlDNA酶；0.1-0.2mg/mlI型胶原酶；0.1-0.2mg/mlIV型胶原酶；0.04-0.1mg/ml分散酶；0.1-0.5mg/ml蛋白酶XIV；0.1-3mg/ml链丝菌蛋白酶E；以及0.2-0.5mg/ml胰酶，所述肺脏干细胞分离培养液包含：90体积％的RPMI1640培养基；10体积％的胎牛血清；1-3mmol/LL-谷氨酰胺；0.05-0.15mmol/Lβ-巯基乙醇；100-1000U/ml白血病抑制因子；以及2-5ng/mlEGF生长因子。2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，通过下列任意一种方法制备获得所述经过增殖抑制处理的胚胎成纤维细胞：(1)将胚胎成纤维细胞进行辐照量为30-80Gy的辐照处理1-5小时；(2)将所述胚胎成纤维细胞进行1-30ug/ml丝裂霉素C处理1-5小时，任选地，所述胚胎成纤维细胞来源于小鼠，优选E13.5小鼠，任选地，所述辐照处理是利用细胞辐照仪进行的。3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述组织消化液包含：99体积％的PBS；1U/mlDNA酶；0.15mg/mlI型胶原酶；0.15mg/mlIV型胶原酶；0.07mg/ml分散酶；0.3mg/ml蛋白酶XIV；2mg/ml链丝菌蛋白酶E；以及0.35mg/ml胰酶，所述肺脏干细胞分离培养液包含：90体积％的RPMI1640培养基；10体积％的胎牛血清；2mmol/LL-谷氨酰胺；0.1mmol/Lβ-巯基乙醇；500U/ml白血病抑制因子；以及3.5ng/mlEGF生长因子。4.一种分离获得肺脏干细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：利用组织消化液将包含肺脏干细胞的生物样本进行消化处理，以便获得单细胞；以及将所述单细胞与肺脏干细胞分离培养液混合，并置于经过增殖抑制处理的胚胎成纤维细胞上进行孵育培养，以便获得肺脏干细胞，其中，所述组织消化液包含：99体积％的PBS；0.1-2U/mlDNA酶；0.1-0.2mg/mlI型胶原酶；0.1-0.2mg/mlIV型胶原酶；0.04-0.1mg/ml分散酶；0.1-0.5mg/ml蛋白酶XIV；0.1-3mg/ml链丝菌蛋...

【专利技术属性】
技术研发人员：张婷，
申请(专利权)人：苏州吉美瑞生医学科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32