生成动脉内皮细胞群制造技术

描述了在没有胰岛素的情况下在限定条件下生成人动脉内皮细胞的方法。

The formation of arterial endothelial cells

Methods of generating adult endothelial cells under conditions without insulin are described.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】生成动脉内皮细胞群相关申请的交叉引用本申请要求2015年2月20日提交的美国临时申请第62/118,553号的优先权，其通过引用全文纳入本文。关于联邦资助研究或开发的声明本专利技术在国立卫生院(先进转化科学国家中心)授予的UH2-TR000506的政府资助下完成。政府对本专利技术拥有一定的权利。
技术介绍
心血管疾病在美国是头号死因，并且大部分血管疾病，如动脉粥样硬化，发生在动脉中。动脉粥样硬化是一种慢性炎性疾病，其由内皮细胞的活化、功能障碍和结构变化引发，导致增加的白细胞-内皮粘附。从多潜能干细胞生成动脉内皮细胞对于开发针对疾病或病症的疗法而言前景巨大，该疗法将治疗心血管疾病。然而，动脉内皮发育是充满挑战的，因为原代动脉内皮细胞在培养中经过去分化。例如，Prosper等的美国公开专利申请号2009/0104159描述了培养和使用证明有动脉分化“潜力”的血管内皮细胞的方法(第[0136]段)。另外，McCloskey等的美国公开的专利申请号2012/0064040描述了化学限定的培养条件以从胚胎干细胞衍生内皮细胞。然而，同样，该公开似乎仅仅证明了从胚胎干细胞分化动脉内皮细胞的潜力，并且获得非常低的结果。从人胚胎干细胞衍生动脉内皮细胞的现有方案在很大程度上已经失败。因此，本领域仍然需要用于从人多潜能干细胞生成人动脉内皮细胞的高效、限定和可放大规模的方法。
技术实现思路
在第一方面，本文提供了获得动脉内皮细胞的方法。该方法可包括或基本由以下组成：在无血清、无白蛋白、化学限定的培养基中培养中胚层细胞，该培养基基本没有胰岛素并且包含成纤维细胞生长因子(FGF)，血管内皮生长因子(VEGF)，和以下的至少一种：Notch激动剂、TGF-β抑制剂、和肌醇单磷酸酶的抑制剂，从而获得包含动脉内皮细胞的细胞群。该群的动脉内皮细胞可表达选自下组的一种或多种标志物：肝配蛋白2、神经毡蛋白1(NRP-1)、Δ-样4(DLL4)、肝配蛋白-B2(EFNB2)、CD44、CXCR4/CD184、间隙连接蛋白α-4(GJA4)、Hey1、Jagged-1(JAG1)、Notch1、和Notch4。该细胞群可包含至少80％动脉内皮细胞。无血清、无白蛋白、化学限定的培养基可包含FGF、VEGF、Notch激动剂、TGF-β抑制剂、和肌醇单磷酸酯抑制剂。中胚层细胞可表达选自下组的一种或多种中胚层标志物：短尾基因(Brachyury)(T)、EMOS、FOXA2、MIXL1、MSX1、和MSX2。在一些情况中，通过在包含骨形态发生蛋白(BMP)、激活素A、和Wnt/β-联蛋白信号转导的激活剂的无血清、无白蛋白、化学限定的细胞培养基中培养人多潜能干细胞持续约2天的时间以获得包含中胚层细胞的细胞群来获得中胚层细胞。中胚层细胞可表达选自下组的一种或多种中胚层标志物：短尾基因(Brachyury)(T)、EMOS、FOXA2、MIXL1、MSX1、和MSX2。多潜能干细胞可以是人胚胎干细胞或人诱导型多潜能干细胞。Wnt/β-联蛋白信号转导的激活剂可以是Gsk3抑制剂。Gsk3抑制剂可选自下组：CHIR99021、CHIR98014、BIO-丙酮肟、BIO、LiCl、SB216763、SB415286、ARA014418、1-氮杂坎帕罗酮(1-Azakenpaullone)、和双-7-吲哚基马来酰亚胺。Notch激动剂可选自下组：白藜芦醇(3,4',5-三羟基茋)、丙戊酸、和辛二酰二羟肟酸。TGF-β抑制剂可以是SB431542。肌醇单磷酸酯的抑制剂可以是L-690,330。在另一个方面，本文提供了按照本文提供的方法获得的基本纯的，动脉内皮细胞的分离群。分离群可包含至少90％动脉内皮细胞或至少99％动脉内皮细胞。在另一个方面，本文提供了按照本文提供的方法获得的基本纯的，多潜能干细胞衍生的动脉内皮细胞的分离群。分离群可包含至少90％动脉内皮细胞或至少99％动脉内皮细胞。在另一个方面中，提供了一种体外筛选试剂的方法。该方法可包括使测试试剂与按照本文提供的方法获得的动脉内皮细胞接触；并且检测该试剂对接触的动脉内皮细胞的效果。检测可包括进行选自下组的方法：RNA测序、基因表达概况分析、转录组分析、代谢组分析、检测报告物或感测物、蛋白质表达概况分析、福斯特共振能量转移(FRET)、代谢概况分析、和微量透析。在另一个方面中，本文提供了用于获得动脉内皮细胞的试剂盒，该试剂盒包含：(i)适于将中胚层细胞分化成动脉内皮细胞的无血清、无白蛋白、化学限定的培养基，其中该培养基基本不含胰岛素并且包含成纤维细胞生长因子(FGF)，血管内皮生长因子(VEGF)，和以下的至少一种：Notch激动剂、TGF-β抑制剂、和肌醇单磷酸酶的抑制剂；和(ii)描述用于将中胚层细胞分化成动脉内皮细胞的方法的说明，该方法采用所述培养基。该试剂盒还可包含(a)适于将人多潜能干细胞分化成中胚层细胞的无血清、无白蛋白、化学限定的培养基，其中该培养基包含BMP、激活素A、和Wnt/β-联蛋白信号转导的激活剂；(b)描述用于将人多潜能干细胞分化成动脉内皮细胞的方法的说明，该方法采用(a)的培养基。通过下文描述将能够更好地理解本专利技术的这些和其它特征、方面和益处。在以下说明书中，参照构成说明书的一部分的附图，其中以说明性方式显示，但不限于，本专利技术的优选实施方式。关于优选实施方式的描述并不意在限制本专利技术以覆盖全部修改形式、等同形式和替代形式。因此应当参考用于对本专利技术的全部范围进行解释的所附的权利要求。附图的简要说明以下附图形成本专利技术说明书的部分并且包括以进一步证明本文提供的方法和组合物的某些方面。可参照这些附图中的一幅或者多幅并结合本文所示具体实施方式的详细描述来更好地理解本专利技术。图1A-1D证明了单细胞RNA-seq。(A)对单细胞的动脉和静脉基因的分级聚类分析。(B)5个细胞亚群的平均动脉和静脉基因表达。在各亚群中，各基因的平均TPM(转录本/百万)经计算并标准化至群P1(动脉基因)或P3(静脉基因)。所有动脉基因或静脉基因的标准化的表达被进一步平均并显示在柱形图中。数据表示为平均值±SD。*:P<0.05，P1中，n＝13个细胞，P3中n＝10个细胞。(C)P1和P3的主成分分析。由SingularTMAnalysisToolset2.1生成图。(D)动脉富集基因。P1的各基因的平均TPM与P3比较以计算倍数变化。也通过比较P1-P3来计算P-值。动脉富集基因以倍数变化>2，P值<0.1，并且P1的平均TPM>10来鉴定。P<0.1被用作截止值，因为之前报道的动脉基因VEGFa、Fzd4、Fzd7、Fzd10、Dll4、和Notch4的P值为0.01-0.1。图2A提供了使用表1中列出的化学限定的培养基从人多潜能干细胞生成动脉内皮细胞的方案的示意图。首先使用E8BAC培养基将人胚胎干细胞(ES)分化成中胚层细胞。然后，用补充生长因子或小分子(E6FVB)的E6培养基诱导中胚层细胞以分化成内皮细胞。图2B是在第0天(未分化的多潜能状态)和第5天(分化的状态)的CD31和CD34表达的流式细胞数据。图2C是在第0天和第5天的KDR、NANOG、和OCT4表达的流式细胞数据。图2D本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种获得动脉内皮细胞的方法，所述方法包括在无血清、无白蛋白、化学限定的培养基中培养中胚层细胞，该培养基基本没有胰岛素并且包含成纤维细胞生长因子(FGF)，血管内皮生长因子(VEGF)，和以下的至少一种：Notch激动剂、TGF‑β抑制剂、和肌醇单磷酸酶抑制剂，从而获得包含动脉内皮细胞的细胞群，其中所述群的动脉内皮细胞表达选自下组的一种或多种标志物：肝配蛋白B2(EFNB2)、神经毡蛋白1(NRP‑1)、Δ‑样4(DLL4)、CD44、CXCR4/CD184、间隙连接蛋白α‑4(GJA4)、Hey1、Jagged‑1(JAG1)、Notch1、和Notch4。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.02.20 US 62/118,5531.一种获得动脉内皮细胞的方法，所述方法包括在无血清、无白蛋白、化学限定的培养基中培养中胚层细胞，该培养基基本没有胰岛素并且包含成纤维细胞生长因子(FGF)，血管内皮生长因子(VEGF)，和以下的至少一种：Notch激动剂、TGF-β抑制剂、和肌醇单磷酸酶抑制剂，从而获得包含动脉内皮细胞的细胞群，其中所述群的动脉内皮细胞表达选自下组的一种或多种标志物：肝配蛋白B2(EFNB2)、神经毡蛋白1(NRP-1)、Δ-样4(DLL4)、CD44、CXCR4/CD184、间隙连接蛋白α-4(GJA4)、Hey1、Jagged-1(JAG1)、Notch1、和Notch4。2.如权利要求1所述的方法，其中所述细胞群包含至少80％动脉内皮细胞。3.如权利要求1所述的方法，其中所述无血清、无白蛋白、化学限定的培养基包含FGF、VEGF、Notch激动剂、TGF-β抑制剂、和肌醇单磷酸酯的抑制剂。4.如权利要求1所述的方法，其中所述中胚层细胞表达选自下组的一种或多种中胚层标志物：短尾基因(T)、EMOS、FOXA2、MIXL1、MSX1、和MSX2。5.如权利要求1所述的方法，其中通过在包含骨形态发生蛋白(BMP)、激活素A、和Wnt/β-联蛋白信号转导的激活剂的无血清、无白蛋白、化学限定的细胞培养基中培养人多潜能干细胞持续约2天的时间以获得包含中胚层细胞的细胞群来获得所述中胚层细胞。6.如权利要求5所述的方法，其中所述中胚层细胞表达选自下组的一种或多种中胚层标志物：短尾基因(T)、EMOS、FOXA2、MIXL1、MSX1、和MSX2。7.如权利要求5所述的方法，其中所述多潜能干细胞是人胚胎干细胞或人诱导型多潜能干细胞。8.如权利要求5所述的方法，其中所述Wnt/β-联蛋白信号转导的激活剂是Gsk3抑制剂。9.如权利要求8所述的方法，其中所述Gsk3抑制剂选自下组：CHIR99021、CHIR98014、BIO-丙酮肟、BIO、LiCl、SB216763、SB415286、ARA014418、1-氮杂坎帕罗酮、和双-7-吲哚基马来酰亚胺。10.如权利要求5所述的方法，其中所述Notch激动剂选自下组：...

【专利技术属性】
技术研发人员：J·A·汤姆森，张决，
申请(专利权)人：威斯康星校友研究基金会，
类型：发明
国别省市：美国,US