多潜能干细胞衍生的多巴胺能亚型神经元祖细胞的体外扩增制造技术

本文描述了用于扩增多巴胺能神经元祖细胞的方法和组合物，包括使用至少具有以下成分的组合物和培养基：FGF、SHH信号转导激动剂、经典Wnt信号转导激动剂和Wnt

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】多潜能干细胞衍生的多巴胺能亚型神经元祖细胞的体外扩增
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请要求2019年12月9日提交的美国临时申请第62/945,366号的权益，该申请通过引用全文纳入本文。
[0003]关于联邦资助研究或开发的声明
[0004]本专利技术是在美国国立卫生研究院授予的NS076352和NS096282的政府支持下完成的。政府对本专利技术享有某些权利。

技术介绍

[0005]美国有100多万帕金森病(PD)患者。PD是由中脑多巴胺(DA)神经元的缺失引起的。目前的治疗方法包括L
‑
多巴和脑深部刺激的使用，可以治疗症状，但不能阻止疾病的进展。因此，有必要开发新的疗法来阻止/逆转疾病进程或再生PD中丢失的神经元。人多潜能干细胞(hPSC)为产生真正多巴胺神经元提供了一个有希望的来源，用于开发帕金森病的疾病修饰疗法。这可通过构建基于人多巴胺神经元的药物发现平台来实现，该平台用于鉴别预防或延迟DA神经元变性过程的药物，或移植DA神经元以替换PD患者的变性细胞。
[0006]为了通过高通量筛选(HTS)发现药物，或者为数百或数千名患者进行细胞移植治疗，需要数十亿个DA神经元。产生大量DA神经元的一种方法是从大量干细胞开始。这种策略需要多批次产生DA神经元，但这会在批次之间产生差异。另一种方法是通过生长因子扩增诱导的DA神经元祖细胞，但目前用于扩增命运定向(fate
‑
commited)祖细胞的方法总是会导致失去其原来的命运特性，即DA神经元特性的丧失。特别是，诱导DA神经元祖细胞产生大型投射神经元(如中脑多巴胺神经元)的能力在两到四代内消退，并被其他神经元群体所取代。
[0007]因此，持续需要改进方法和组合物，以产生大量适合分化为多巴胺神经元的一致DA神经元祖细胞，它们的量足以进行高通量筛选和细胞治疗。

技术实现思路

[0008]本文描述的方法、组合物和试剂盒解决了多巴胺能神经元祖细胞常规扩增方案的上述缺点。
[0009]在第一方面中，本文提供了一种用于扩增多巴胺能神经元祖细胞的方法。该方法可包括或基本上由以下组成：将多巴胺能神经元祖细胞与包含成纤维细胞生长因子8b(FGF8b)、Hedgehog(Hh)信号转导激动剂、经典Wnt信号转导小分子激动剂和Wnt
‑
C59的培养基接触，以产生扩增的多巴胺能神经元祖细胞群。Hh信号转导的激动剂可从由Smoothened激动剂(SAG)、SAG类似物、SHH、SHH C25II、C24
‑
SHH、嘌吗啡胺、Hg
‑
Ag及其衍生物组成的组中选择。经典Wnt信号转导的小分子激动剂可以是糖原合成酶激酶3抑制剂。糖原合成酶激酶3抑制剂是CHIR99021、1
‑
氮杂坎帕罗酮、AR
‑
A014418、靛玉红
‑3′‑
单肟、5
‑
碘
‑
靛玉红
‑3′‑
单肟、坎帕罗酮、SB
‑
415286、SB
‑
216763、2
‑
苯胺基
‑5‑
苯基
‑
1,3,4
‑
噁二唑、(Z)
‑5‑
(2,3
‑
甲撑二氧基苯基)咪唑啉
‑
2,4
‑
二酮、TWS119、CHIR98014、SB415286、Tideglusib、LY2090314、
锂盐或其组合。糖原合成酶激酶3抑制剂可以是CHIR99021，并且可以约0.01微摩尔(μM)到约1毫摩尔(mM)的浓度存在于培养基中。CHIR99021可以约0.6μM的浓度存在于培养基中。WNT
‑
C59可以约0.2微摩尔(μM)至约2μM的浓度存在于培养基中。WNT
‑
C59可以约0.5μM的浓度存在于培养基中。多巴胺能神经元祖细胞在体外可扩增至少300倍。培养基可进一步包含神经补剂B27。多巴胺能神经元祖细胞在体外可扩增至少1000倍。在一些实施方式中，培养基包含约50ng/ml FGF8b、约25ng/ml SHH、约0.6μMCHIR99021和约0.5μM WNT
‑
C59。多巴胺能神经元祖细胞可传代培养至少6次而不丢失表型或基因型。培养基可以是化学组成明确的、无血清且不含异种物质的。
[0010]在另一方面，本文提供了根据本专利技术方法获得的基本上纯的人多巴胺能神经元祖细胞群。
[0011]在另一方面中，本文提供包含FGF8b、Hh信号转导激动剂、经典Wnt信号转导小分子激动剂和Wnt
‑
C59的组合物。组合物还可包含B27。在一些情况下，该组合物基本上由FGF8b、Hh信号转导激动剂、经典Wnt信号转导小分子激动剂和Wnt
‑
C59组成。在一些情况下，该组合物基本上由FGF8b、Hh信号转导激动剂、经典Wnt信号转导小分子激动剂、Wnt
‑
C59和B27组成。经典Wnt信号转导的小分子激动剂可以是糖原合成酶激酶3抑制剂，选自CHIR99021、1
‑
氮杂坎帕罗酮、AR
‑
A014418、靛玉红
‑3′‑
单肟、5
‑
碘
‑
靛玉红
‑3′‑
单肟、坎帕罗酮、SB
‑
415286、SB
‑
216763、2
‑
苯胺基
‑5‑
苯基
‑
1,3,4
‑
噁二唑、(Z)
‑5‑
(2,3
‑
甲撑二氧基苯基)咪唑啉
‑
2,4
‑
二酮、TWS119、CHIR98014、SB415286、Tideglusib、LY2090314、锂盐或其组合。Hedgehog(Hh)信号转导的激动剂可从由Smoothened激动剂(SAG)、SAG类似物、SHH、SHH C25II、C24
‑
SHH、嘌吗啡胺、Hg
‑
Ag及其衍生物组成的组中选择。组合物可配制成细胞培养基。
[0012]通过下面的描述，将更好地理解本专利技术的这些和其他特征、目的和优点。在以下说明书中，参照构成说明书的一部分的附图，其中以说明性方式非限制性显示了本专利技术的实施方式。优选实施方式的描述并不旨在限制本专利技术并涵盖所有修改、等效方式和备选方案。因此，为了解释本专利技术的范围，应参考本文所述的权利要求。
[0013]通过引用纳入
[0014]本说明书中提到的所有发表物、专利和专利申请通过引用纳入本文，就好像将各篇单独的发表物、专利或专利申请专门和单独地通过引用纳入本文那样。
[0015]附图简要说明
[0016]当考虑以下的详细描述时，本专利技术将被更好地理本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种扩增多巴胺能神经元祖细胞的方法，包括将多巴胺能神经元祖细胞与包含成纤维细胞生长因子8b(FGF8b)、Hedgehog(Hh)信号转导激动剂、经典Wnt信号转导小分子激动剂和WNT
‑
C59的培养基接触，以产生扩增的多巴胺能神经元祖细胞群。2.如权利要求1所述的方法，其中Hh信号转导激动剂选自由Smoothened激动剂(SAG)、SAG类似物、SHH、SHH C25II、C24
‑
SHH、嘌吗啡胺、Hg
‑
Ag及其衍生物组成的组。3.如权利要求1所述的方法，其中所述经典Wnt信号转导的小分子激动剂是糖原合成酶激酶3抑制剂。4.如权利要求3所述的方法，其中糖原合成酶激酶3抑制剂是CHIR99021、1
‑
氮杂坎帕罗酮、AR
‑
A014418、靛玉红
‑3′‑
单肟、5
‑
碘
‑
靛玉红
‑3′‑
单肟、坎帕罗酮、SB
‑
415286、SB
‑
216763、2
‑
苯胺基
‑5‑
苯基
‑
1,3,4
‑
噁二唑、(Z)
‑5‑
(2,3
‑
甲撑二氧基苯基)咪唑啉
‑
2,4
‑
二酮、TWS119、CHIR98014、SB415286、Tideglusib、LY2090314、锂盐或其组合。5.如权利要求3所述的方法，其中该糖原合成酶激酶3抑制剂是CHIR99021且以约0.01微摩尔(μM)至约1毫摩尔(mM)的浓度存在于培养基中。6.如权利要求5所述的方法，其中CHIR99021以约0.6μM的浓度存在于培养基中。7.如权利要求1所述的方法，其中WNT
‑
C59以约0.2微摩尔(μM)至约2μM的浓度存在于培养基中。8.如权利要求7所述的方法，其中WNT
‑
C59以约0.5μM的浓度存在于培养基中。9.如权利要求1所述的方法，其中所述多巴胺能神经元祖细胞在体外扩增至少300倍。10...

【专利技术属性】
技术研发人员：SC，
申请(专利权)人：威斯康星校友研究基金会，
类型：发明
国别省市：