外周血单个核细胞的分离方法技术

本发明专利技术公开了一种外周血单个核细胞的分离方法，包括以下步骤：(1)将外周血与杜氏磷酸缓冲液混匀得到稀释后的外周血；将淋巴细胞分离液装于离心管中并遮光保存；(2)倾斜装有淋巴细胞分离液的离心管，使淋巴细胞分离液的液面与水平面呈50°～70°角；将稀释后的外周血沿离心管的侧壁加入到淋巴细胞分离液中得到混合液；稀释后的外周血与淋巴细胞分离液的体积比为1～2：1；(3)装有混合液的离心管离心分离并取白膜层，即得到外周血单个核细胞层。该分离方法，操作简单，适合大量样本的分离；能够实现无菌操作，得到的外周血单个核细胞适宜临床应用；对分离的外周血单个核细胞的损伤很小，细胞得率高，分离过程中也不会受到干扰。

Method for isolation of peripheral blood mononuclear cells

The invention discloses a method for separating mononuclear cells in a peripheral blood, which comprises the following steps: (1) the peripheral blood and from phosphate buffer mixing to obtain peripheral blood diluted; the lymphocyte separation liquid installed in the centrifuge tube and shading preservation; (2) with lymph cell centrifugal inclination the liquid separation tube, so that the level of lymphocyte separation liquid and the horizontal plane 50 degrees to 70 degrees; the peripheral blood diluted along the side walls of the centrifuge tube to get lymphocyte separation liquid mixture; separation of peripheral blood lymphocytes and diluted the volume ratio of 1 ~ 2:1 (3; a mixed liquid pipe) centrifugal centrifugal separation and albuginea, the peripheral blood mononuclear cells. The operation of the separation method, simple, suitable for mass sample separation; to achieve aseptic operation, the peripheral blood mononuclear cells suitable for clinical application; on the separation of peripheral blood mononuclear cell damage cells is very small, high yield, no interference in the separation process.

【技术实现步骤摘要】
外周血单个核细胞的分离方法
本专利技术涉及细胞分离
，特别地，涉及一种外周血单个核细胞的分离方法。
技术介绍
在临床研究中，针对特定细胞的功能学和生物学特性的检查常常依赖细胞的分离技术，从外周血以及机体各种体液，例如胸水、腹水中分离单个核细胞是体外进行淋巴细胞免疫学研究和细胞学实验的重要前提。目前热门的细胞免疫治疗疗法是引领未来疾病治疗的新技术，该疗法需要采集人体自身免疫细胞，经过体外培养使其扩增，再经过基因工程改造、特殊培养等处理后，使这些细胞具有增强免疫、杀死病原体和肿瘤细胞、促进组织器官再生和机体康复等治疗功效，从而达到治疗疾病的目的。该疗法具有疗效良好、副作用小、个性化等独特的优势，为癌症、血液病、心血管病、糖尿病、老年痴呆症等疾病提供了良好的治疗效果，在未来治疗中必将担当重要角色。其中，外周血单个核细胞(peripheralbloodmononuclearcell，简称PBMC)是参与机体免疫应答反应的一类重要免疫细胞群。PBMC主要包含淋巴细胞和单核细胞，其中淋巴细胞占比80％～90％，淋巴细胞包括T淋巴细胞和B淋巴细胞两大类，它们根据其表面标记物和功能不同又可以分为不同的细胞亚群，按标记物的不同，T淋巴细胞有CD3+、CD4+、CD8+、CD45+细胞等亚群，按细胞功能的不同，还有辅助T细胞(helperTcells,Th)、效应T细胞(EffectorTcells,Te)和细胞毒性T细胞(CytotoxicTcells,Tc)等等；B淋巴细胞有B1、B2两种亚型。单核细胞占比10％～20％，单核细胞能吞噬异物产生抗体，在机体损伤治愈、抗御病原的入侵和对疾病的免疫方面起着重要的作用。因此，对不同淋巴细胞亚群分离、鉴别以及进行功能研究对疾病诊断乃至治疗都具有十分重要的临床意义。现阶段，分离外周血单个核细胞的方法主要有黏附法、免疫磁珠分离法、流式细胞分离法以及经典的Ficoll-Hypaque密度梯度离心法。黏附法的细胞回收率除了与选择的吸附材料有关外，还与分离时输入细胞的流速有关；此方法有操作麻烦，分离纯度不高，回收率低。免疫磁珠分离法应用的是抗原抗体结合的原理分离细胞，这种方法具有分离纯度高的特点，细胞回收率也高；但是，免疫磁珠分离得到的淋巴细胞的效果和活力受磁珠的种类和抗体的影响，而且成本也很高。流式细胞分离法是20世纪70年代发展起来的细胞鉴定和分选技术，该技术集激光术、计算技术、电子物理技术、光电测量技术、荧光化学技术以及单克隆抗体技术于一体，通过流式细胞仪来实现；流式细胞分离技术已经较为成熟，可以同时检测细胞中DNA的含量、细胞体积、细胞膜受体以及表面抗原、细胞所处周期等许多生物信息；但是，流式细胞术分选细胞的成本较高，分离过程中也会对细胞造成损伤，从而影响细胞的活性。另外，流式细胞分离法无法进行无菌操作，这使得经流式细胞分选的细胞不宜再做培养方面的研究。上述免疫磁珠分离法和流式细胞分离法分离的淋巴细胞对分离样本是有选择的，通常这两种方法使用的样本均是进行过密度梯度离心获得的混合淋巴细胞，这也是上述两种方法可获得较高纯度的细胞的重要原因。因此，外周血单个核细胞最适用的分离方法是Ficoll-Hypaque密度梯度离心法，但此方法依然存在比如对细胞损伤大、细胞得率低、分离过程中容易受到干扰等问题有待进一步解决。
技术实现思路
本专利技术提供了一种外周血单个核细胞的分离方法，以解决现有的密度梯度离心法对细胞损伤大、细胞得率低且不适宜临床应用、分离过程中易受干扰的技术问题。本专利技术采用的技术方案如下：一种外周血单个核细胞的分离方法，包括以下步骤：(1)将外周血与杜氏磷酸缓冲液混匀得到稀释后的外周血；将淋巴细胞分离液装于离心管中并遮光保存；(2)倾斜装有所述淋巴细胞分离液的离心管，使所述淋巴细胞分离液的液面与水平面呈50°～70°角；将所述步骤(1)中得到的稀释后的外周血沿所述离心管的侧壁加入到所述淋巴细胞分离液中得到混合液；所述稀释后的外周血与所述淋巴细胞分离液的体积比为1～2：1；(3)将所述步骤(2)中装有混合液的所述离心管放置在水平离心机中离心分离并取白膜层，即得到所述外周血单个核细胞层。进一步地，所述步骤(1)中外周血与杜氏磷酸缓冲液的体积比为1：1。进一步地，所述步骤(2)中将稀释后的外周血加入到所述淋巴细胞分离液中时，所述淋巴细胞分离液的液面与水平面呈60°角。进一步地，所述步骤(2)中稀释后的外周血与所述淋巴细胞分离液的体积比为3：2。进一步地，所述步骤(3)中离心分离的转速为450～600g；所述离心分离的时间为20～30min。进一步地，所述步骤(3)中离心分离的转速为500g；所述离心分离的时间为25min。进一步地，所述外周血单个核细胞分离的操作温度为20℃。进一步地，所述淋巴细胞分离液包括Ficoll400和泛影葡胺钠，所述淋巴细胞分离液在20℃时的密度为1.077g/mL。根据本专利技术的另一方面，还提供了一种上述分离方法分离得到的外周血单个核细胞，对所述外周血单个核细胞培养后进行流式细胞分析，得到所述外周血单个核细胞的活性为96％～98％。进一步地，将上述分离方法分离得到的所述外周血单个核细胞与杜氏磷酸缓冲液混匀，于水平离心机离心分离，得到细胞沉淀；将所述细胞沉淀中加入所述杜氏磷酸缓冲液，吹打混匀得到细胞悬液进行细胞计数。进一步地，所述细胞计数的方法为吸取所述细胞悬液和浓度为0.4％的台盼蓝溶液混匀，检测细胞活力。进一步地，将所述细胞悬液置入离心机中，20℃、500g转速下离心，得到细胞沉淀，向所述细胞沉淀中加入含10％胎牛血清的RPMI1640细胞培养基，混匀，置于37℃、5％二氧化碳培养箱中培养。本专利技术具有以下有益效果：1、本专利技术的外周血单个核细胞的分离方法，对现有的密度梯度离心法进行了改进，操作简单，适合大量样本的分离；并能够实现无菌操作，分离得到的外周血单个核细胞适宜临床应用；对分离的外周血单个核细胞的损伤很小，细胞得率高，分离过程中也不会受到干扰。2、本专利技术分离方法分离得到的外周血单个核细胞，可用于肿瘤免疫疗法中对大规模血液单个核细胞的需求；可以提供同一个包含大量个体的单个核细胞，该方法分离的血液细胞纯度以及活性较高；可进行二次筛选，直接用于针对T淋巴细胞以及B淋巴细胞的治疗性研究。除了上面所描述的目的、特征和优点之外，本专利技术还有其它的目的、特征和优点。下面将参照图，对本专利技术作进一步详细的说明。附图说明构成本申请的一部分的附图用来提供对本专利技术的进一步理解，本专利技术的示意性实施例及其说明用于解释本专利技术，并不构成对本专利技术的不当限定。在附图中：图1是本专利技术优选实施例的外周血中不同组分的比重示意图；图2是本专利技术优选实施例的外周血中分离的单个核细胞示意图；图3是本专利技术优选实施例中核算染料Propidiumiodide(PI)测定活细胞数目的数据图；图4是本专利技术优选实施例的单个核细胞中五种亚型细胞的流式分群图。具体实施方式以下结合附图对本专利技术的实施例进行详细说明，但是本专利技术可以由权利要求限定和覆盖的多种不同方式实施。本专利技术提供了一种外周血单个核细胞的分离方法，包括以下步骤：(1)将外周血与杜氏磷酸缓冲液混匀得到稀释后的外周血；将淋巴细胞分离液装于离心管中并遮光本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种外周血单个核细胞的分离方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将外周血与杜氏磷酸缓冲液混匀得到稀释后的外周血；将淋巴细胞分离液装于离心管中并遮光保存；(2)倾斜装有所述淋巴细胞分离液的离心管，使所述淋巴细胞分离液的液面与水平面呈50°～70°角；将所述步骤(1)中得到的稀释后的外周血沿所述离心管的侧壁加入到所述淋巴细胞分离液中得到混合液；所述稀释后的外周血与所述淋巴细胞分离液的体积比为1～2：1；(3)将所述步骤(2)中装有混合液的所述离心管放置在水平离心机中离心分离并取白膜层，即得到所述外周血单个核细胞层。

【技术特征摘要】
1.一种外周血单个核细胞的分离方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将外周血与杜氏磷酸缓冲液混匀得到稀释后的外周血；将淋巴细胞分离液装于离心管中并遮光保存；(2)倾斜装有所述淋巴细胞分离液的离心管，使所述淋巴细胞分离液的液面与水平面呈50°～70°角；将所述步骤(1)中得到的稀释后的外周血沿所述离心管的侧壁加入到所述淋巴细胞分离液中得到混合液；所述稀释后的外周血与所述淋巴细胞分离液的体积比为1～2：1；(3)将所述步骤(2)中装有混合液的所述离心管放置在水平离心机中离心分离并取白膜层，即得到所述外周血单个核细胞层。2.根据权利要求1所述的外周血单个核细胞的分离方法，其特征在于，所述步骤(1)中外周血与杜氏磷酸缓冲液的体积比为1：1。3.根据权利要求1所述的外周血单个核细胞的分离方法，其特征在于，所述步骤(2)中将稀释后的外周血加入到所述淋巴细胞分离液中时，所述淋巴细胞分离液的液面与水平面呈60°角。4.根据权利要求1所述的外周血单个核细胞的分离方法，其...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙俊，张金保，陈燕，
申请(专利权)人：妙顺上海生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31