本发明专利技术公开了一种检测外周血CAR‑T细胞的TaqMan实时荧光定量PCR试剂盒，包括序列分别如SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7所示的上游引物、下游引物及探针。该TaqMan实时荧光定量PCR试剂盒具有取材量小、操作简便且检测周期短的优点，能够用于外周血CAR‑T细胞的检测。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物医学领域，尤其是关于一种针对外周血CAR-T细胞的检测技术。
技术介绍
嵌合抗原受体T细胞免疫疗法(ChimericAntigenReceptorT－CellImmunotherapy，CAR－T)是近年来迅速发展的肿瘤过继免疫治疗方法。CAR-T治疗已成为治疗恶性肿瘤的一种新策略，特别是在血液肿瘤方面的贡献，主要涉及急性淋巴细胞白血病(ALL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、B细胞淋巴瘤/白血病、霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤。CAR-T疗法主要分4步：一是从肿瘤患者上分离免疫系统的T细胞；二是利用基因工程技术给T细胞加入一个能识别肿瘤细胞、同时激活T细胞杀死肿瘤细胞的嵌合体，成为CAR-T细胞；三是在体外选择、激活和大量扩增CAR-T细胞(一般一个病人需要几十亿乃至上百亿个CAR-T细胞)；四是给肿瘤患者输注CAR-T细胞，发挥对肿瘤细胞的杀伤效应。CAR-T细胞发挥杀伤肿瘤效应取决于患者体内的CAR-T细胞的数量和存活时间。而CAR-T细胞的扩增和存活受到诸多因素的影响，如最初输注的CAR-T细胞数量、输注前是否进行“淋巴细胞清除”以及病人的输注后的个体治疗等。相关研究报道新一代的CAR-T细胞能够在患者体内扩增超过1000倍，并能够到达骨髓，在体内保持较高的CAR功能达6个月。但外周血中CAR-T细胞数，在患者个体间的差异大，CAR-T细胞数量成为临床预后预测，疗效评价的一项重要的参数。
技术实现思路
本专利技术提供一种新的外周血CAR-T细胞检测方法。本专利技术提供一种检测外周血CAR-T细胞的TaqMan实时荧光定量PCR试剂盒，包括序列分别如SEQIDNO：5、SEQIDNO：6和SEQIDNO：7所示的上游引物、下游引物及探针。一种TaqMan实时荧光定量PCR试剂盒在外周血CAR-T细胞检测上的应用，所述试剂盒包括序列分别如SEQIDNO：5、SEQIDNO：6和SEQIDNO：7所示的上游引物、下游引物及探针。最低的有效检测浓度为1.2×101copies/μL。本专利技术的有益效果是：该TaqMan实时荧光定量PCR试剂盒具有取材量小、操作简便且检测周期短的优点，能够用于外周血CAR-T细胞的检测。附图说明图1是GAPDH标准曲线图；图2是CAR标准曲线图；图3是不同样本的扩增曲线图，其中，A-G分别为浓度1.2×107-1.2×101copies/μL样本，即浓度分别为1.2×107copies/μL、1.2×106copies/μL、1.2×105copies/μL、1.2×104copies/μL、1.2×103copies/μL、1.2×102copies/μL和1.2×101copies/μL；H：1.2copies/μL样本；I：ddH2O样本；图4是反映两例患者体内CAR-T细胞数随时间的变化情况图。具体实施方式下面通过具体实施方式结合附图对本专利技术作进一步详细说明。1材料和方法1.1样本、试剂及仪器样本：选取2015年1月至2016年6月深圳市第二人民医院血液内科收治的进行CAR-T治疗的淋巴系统肿瘤患者，另随机选择来深圳市第二人民医院健康体检者的血液样本为对照组。试剂：血液基因组DNA提取试剂盒(天根生化科技有限公司)，DNA纯化回收试剂盒(天根生化科技有限公司)，PCRMaster试剂(TaKaRa公司)，TaqManGeneExpressionMasterMix试剂(ABI公司)，TaqManGeneExpressionAssay(Hs02758991_g1)试剂(ABI公司)。仪器：ABI7500荧光定量PCR检测仪(ABI公司)，ProflexPCR仪(ABI公司)，NanoDrop2000c微量核酸蛋白分析仪(THERMO公司)。1.2方法1.2.1引物设计与合成根据引物设计原则，采用Primer5软件完成引物设计，引物委托华大基因生物公司合成。采用Oligo7软件完成CAR基因探针设计，委托英潍捷基(上海)贸易有限公司合成。其中GAPDH基因探针及引物直接购于美国应用生物系统公司。表1PCR引物序列1.2.2常规PCR产物回收及鉴定参照试剂盒说明书进行操作用血液基因组DNA提取试剂盒提取CAR-T细胞的基因组DNA。普通PCR方法扩增CAR基因(上下游引物序列分别如SEQIDNO：1和SEQIDNO:2所示)和内参GAPDH基因(上下游引物序列分别如SEQIDNO：3和SEQIDNO:4所示)，分别制备标准品。引物序列如表1所示。反应体系：EmeraLdAmppcrMasterMix(2×Premix)25μL，模板DNA5μL，上下游引物(10μmol/L)各1μL，加入ddH2O至总反应体积50μL。进行以下扩增：95℃预变性10min，95℃变性30S，52℃退火60S(GAPDH基因为56℃退火60S)，72℃延伸1min，扩增35个循环，72℃反应5min，4℃保存。所获得扩增产物1.5％琼脂糖凝胶电泳，DNA纯化回收试剂盒回收，送英潍捷基公司测序验证，得到CAR基因和GAPDH基因标准品。1.2.3TaqMan实时荧光定量PCR反应条件优化标准品用ddH2O以10倍浓度梯度稀释作为实时荧光定量PCR模板，每个浓度3个复孔，以ddH2O作为阴性对照，进行TaqMan实时荧光定量PCR。CAR基因检测：引物和探针序列如表1(序列如SEQIDNO：5～7所示)，总反应体系20μL：TaqManGeneExpressionMasterMix(2×)10μL、探针(10μmol/L)2μL、上下游引物(10μmol/L)各1μL、模板DNA4μL，ddH2O2μL。反应程序为：第一步，50℃2min；第二步，95℃10min；第三步，变性95℃15s，退火59℃30s，共进行40个循环。GAPDH基因检测：引物和探针混于TaqManGeneExpressionAssay中。总反应体系20μL：TaqManGeneExpressionMasterMix(2×)10μl、TaqManGeneExpressionAssay(20×)2μL，DNA模板4μL，ddH2O4μL。反应程序为:第一步，50℃2min；第二步，95℃10min；第三步，变性95℃15s，退火60℃60s，共进行40个循环。1.2.4制作标准曲线根据公式DNA拷贝数Ymolecules/μL＝[(DNAng/μL)×10-9/基因碱基长度bp×660]×6.022×1023，算出两基因拷贝数为1.2×1010copies/μL(CAR基因)和1.5×1010copies/μL(GAPDH基因)。以DNA拷贝数为横坐标，CT值为纵坐标，制作标准曲线。为提高扩增效率与灵敏度，CAR基因产物选择稀释倍数105～109；GAPDH基因产物则取102～106浓度的产物(如表2所示)。表2两基因浓度表1.2.5重复性实验采用最优体系，以DNA浓度稀释105、107、109倍的样本进行重复性实验，每个浓度重复5次。测得的CT值进行统计学分析，以变异系数情况确定该反应的重复性。1.2.6灵敏度实验选择各个梯度的标准品和ddH2O作为模板进行实时荧光定本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种检测外周血CAR‑T细胞的TaqMan实时荧光定量PCR试剂盒，其特征在于，包括序列分别如SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7所示的上游引物、下游引物及探针。
【技术特征摘要】
1.一种检测外周血CAR-T细胞的TaqMan实时荧光定量PCR试剂盒，其特征在于，包括序列分别如SEQIDNO：5、SEQIDNO：6和SEQIDNO：7所示的上游引物、下游引物及探针。2.一种TaqMan实时荧光定量PCR试剂盒在外周...
【专利技术属性】
技术研发人员：张巧霞，王恒，杜新，陈伟红，
申请(专利权)人：深圳市第二人民医院，
类型：发明
国别省市：广东;44
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