多基因座STR分析方法技术

本发明专利技术公开了一种多基因座STR分析方法，该方法利用化学连接将一个特定长度的单链DNA片段有选择地连接到不同荧光标记的STR片段上，从而将单个荧光染料能够标记的STR片段数可以扩展一倍甚至更多；并解决了当多色染料(多于5色)用来标记更多STR片段时，会因染料间较严重的荧光光谱交叉问题而在被检测时难以确定各个特定的染料，从而不能确定所标记片段的基因座归属(即基因分型)问题。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及DNA荧光标记以及多基因座基因小片段检测
，具体涉及一种DNA片段的化学连接技术和通过毛细管电泳的荧光光谱采集和分析技术。
技术介绍
随着人类基因组计划的完成，人类对自身遗传信息的了解和掌握有了前所未有的进步。DNA检测技术得到了迅猛发展，DNA检测效率不断提高。DNA检测技术在个体识别、遇难者身份识别、亲子鉴定、血缘鉴定、刑事案件侦破、食品与种子安全、疾病诊断，精准医疗等方面发挥着十分重要的作用。每个人的DNA都不同，因此理论上讲，通过全基因测序可以确定每个人的独特身份。但是人体的DNA包含近30亿个碱基，而且不同人之间99.5％以上的DNA序列是相同的，因此，通过全基因测序确定个人身份的做法会耗时耗力，而且完全没有必要，只需要对人类在存在差别的基因座上进行检测甄别即可。目前商业上的做法是通过多基因座下的STR片段检测来建立每个人的DNA数据库，用于鉴定个人身份。身份鉴定技术通常又称为基因扫描技术，其原理如下：正常人体有23对染色体，共46条染色体。每一条染色体由两条双链DNA组成，每一条双链DNA是由两条碱基互补的单链DNA构成。每一条单链DNA上有很多的编码区(即基因区)和非编码区，它们以线形交替形式排列在DNA链上。这些非编码区通常是一段以某短碱基序列(一般在2到6个碱基)作多次重复出现的DNA片段，简称短序列串联重复单元(ShortTandemRepeats，STR)。大量的研究发现，每个非编码区内的STR呈现多态性，即不同的生物个体在同一个非编码区内的STR重复数目可能不同，而且不同的非编码区内STR重复单元的碱基序列和重复数目也是完全独立的，彼此不关联。因此，这些非编码区内的DNA序列是用来区分不同生物个体(包括人类本身)的绝佳对象。例如，如果一个基因座下存在10种多态性(即10个不同的重复数目)，那么选取10个基因座，理论上存在1010＝100亿种多态性。因此通过检测多个非编码区内的STR片段，就可区分每个人的独特身份。目前英国采用11个基因座，美国采用13个基因座，而中国采用18-22个基因座。但是，在很多情况下，这么多的基因座数目还不足以确定一个人的身份或特点，就需要增加更多的基因座来进行更准确可靠的身份鉴定。多基因座的STR多态性可通过精心设计特定的双向引物(其中正向引物用某个特定的染料标记)，经PCR技术实现对DNA模板链上包含重复单元的非编码区短序列进行复制和扩增，再利用毛细管电泳和荧光检测技术确定各片段的重复单元数目和基因座归属，即基因分型。目前市场上通常使用五色荧光染料来实现基因扫描，不同试剂盒所检测的DNA片段长度范围略有变化，大致在80-350bp之间。其中，一种荧光染料标记一组长度不同的片段，用作内标(即确定DNA长度的标尺)，其余四种染料分别用来标记多个基因座。当用四色染料标记18个基因座时，显然多个基因座必须共用同一种染料来标记。基因座归属是根据颜色和片段长度两个参数来确定的。因此，为了能够确定同一种染料标记下的不同片段基因座的归属，这些片段长度必须预先精心设计，让不同基因座下的STR片段在80-350bp之间各占据一个特定的区间，彼此长度范围不能出现重叠。在实际工作中，很多检材采用通用试剂盒检测分析还不能作出准确判断时，就需要设计具有更多基因座数目的试剂盒，通过扩大DNA片段长度的检测范围以容纳更多的STR片段或增加更多荧光染料实现对增加的基因座进行标记。在一些情况下，例如刑事犯罪中生物样品高度降解时，样品的DNA模板链发生断裂，其相应的完整基因座STR片段就难以通过PCR技术复制，因而不仅造成相关基因座的信息丢失，而且因复制失败只能产生较小的片段，这些片段与其他小片段区发生重叠，严重干扰检测结果。因此，通过扩大DNA片段长度的检测范围以容纳更多的STR片段的策略受到极大的限制，市场上多采用增加荧光染料来标记更多基因座的方法。目前商业上使用的五色染料体系难以在80-350bp的狭窄区间之内实现对更多基因座的荧光标记并且序列长度不交叉排布。显而易见，这种五色体系的应用有较大的局限性。其具体表现在：(1)基因座数目不够多。在多样品混合的情况下，采用较少的基因座数目作基因扫描时不一定能够准确检出混合样品中各组分对应的单个身份。尤其是当样品发生降解时，一些基因座的STR片段因不能被PCR技术扩增出来而无效，那么可以用作鉴定身份的有效基因座STR数目大大下降，从而无法作出准确的身份鉴定；(2)因一种染料已用于标记内标，仅有的四种荧光染料不足以用来标记更多基因座。在样品高度降解的情况下，由于DNA模板断裂不完整，通过PCR技术难以复制和扩增较大的片段。因此在高度降解的生物样品上，广泛采用小卫星或微卫星片段的分析法，即对每个基因座的STR片段尽量选最短的序列，以降低因模板母链降解而不能通过PCR扩增所需的各个基因座STR片段的风险；但是，在一个有限的DNA片段长度范围内，单一染料标记的基因座数目将受到极大限制。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种多基因座STR分析方法，本专利技术方法针对五色荧光染料在多基因座STR检测时的局限性，不仅可以扩展单个荧光染料可标记的基因座STR片段数，而且能够解决多色(5色以上)染料在标记STR片段时因较严重的荧光光谱交叉问题而导致仪器检测时难以确定各个染料标记的片段基因座归属。本专利技术的基本原理如下：每一个基因座中多次重复的STR长度是具有高度多态性的，是现代身份鉴定的基础。仅仅包含多次重复的STR单元本身是很小的。为了让毛细管电泳能够同时分析多个STR片段，这些片段必须在碱基数目，即片段长度上有差别，才能被区分。因此在选择多个基因座的STR长度时，有意在STR重复单元之外多选一些碱基，造成各基因座的STR片段之间不至于发生碱基数相同。在一些情况下，例如高度降解的生物样品中，通过PCR技术复制长的DNA片段非常困难，尽量缩小基因座的STR片段，即采用微卫星片段，是实现样品成功被检测的关键。本专利技术通过预先合成一段与被检样品的序列无关、长度特定的单链DNA片段，然后通过特殊高效的化学连接方法实现与众多小STR片段选择性地对接，让可能重叠的片段发生空间移位从而可被电泳分离。特别指出的是，由于连接所用的长度特定的单链DNA片段与被测样品没有任何关联，因此尽管样品母链因降解发生断裂，但是通过本专利技术的方法仍可以制备片段长度不同且包含各基因座的特征STR片段。本专利技术在不改变目前市场上常用DNA片段长度检测范围的前提下，可以让每一种染料分别标记比原来试剂盒多一倍的基因座STR片段，设计时新增的被标记基因座被编成一组，让组内的各基因座STR片段互相不重叠，而不用考虑与原来同色标记基因座片段长度是否重叠的问题。对新增的基因座，在染料和引物之间需要引入一个带有三个官能团的脚手架小分子，其中的两个官能团与DNA主链构成基本骨架，用于引物和染料之间的连接，第三个则用于与一段外来的长度特定的单链DNA片段进行化学连接。当经过PCR扩增和提纯后，新增的一组片段即可与预先合成的长度特定的DNA片段发生化学反应连接在一起，连接后的DNA片段长度将会增大，而未经脚手架分子修饰的普通方法标记的一组因不能发生化学连接反应，其片段长度不会发生改变。因此，用新本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种多基因座STR分析方法，其特征在于：该方法包括在使用被荧光染料标记的引物对多基因座STR片段进行PCR复制和扩增之后能够将一个长度特定的单链DNA片段连接到部分扩增后的多基因座STR片段上。

【技术特征摘要】
1.一种多基因座STR分析方法，其特征在于：该方法包括在使用被荧光染料标记的引物对多基因座STR片段进行PCR复制和扩增之后能够将一个长度特定的单链DNA片段连接到部分扩增后的多基因座STR片段上。2.根据权利要求1所述的多基因座STR分析方法，其特征在于：所述被荧光染料标记的引物为双向引物中的正向引物或反向引物，且在被荧光染料标记之前，在部分所述正向引物或部分所述反向引物上引入一个脚手架分子。3.根据权利要求2所述的多基因座STR分析方法，其特征在于：所述脚手架分子包括基本骨架和位于所述基本骨架上与所述单链DNA片段发生化学连接的官能团。4.根据权利要求3所述的多基因座STR分析方法，其特征在于：所述基本骨架包括具有式(1)或(2)所示的结构，式(1)和(2)中，n＝1,2,3,4,R为所述骨架上的官能团；或具有式(3)所示的结构，式(3)中，n＝1,2,3,R为所述骨架上的官能团；或具有式(4)所示的结构，式(4)中，n＝1,2；或具有式(5)所示的结构，5.根据权利要求2所述的多基因座STR分析方法，其特征在于：所述单链DNA片段是通过化学合成的引物和生物合成PCR复制扩增获得的一段长度特定的片段，其序列通常与被测样品无关，其长度和序...

【专利技术属性】
技术研发人员：王小兵，陈小颖，李劲东，王贵源，杨旭，万戈江，
申请(专利权)人：贵州申科生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：贵州;52