一种Lasiodiplodia iranensis菌及其发酵产茉莉酸的方法技术

本发明专利技术公开了一种Lasiodiplodia iranensis菌及其发酵产茉莉酸的方法，属于生物技术领域。本发明专利技术提供一株可以产茉莉酸的菌株DWH‑2，经ITS鉴定为Lasiodiplodia iranensis，该菌已于2017年5月27日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO：M2017288。DWH‑2在固体培养基上培养4～5天，转接发酵培养基中静止发酵6～10天，可以产生1500mg/L以上的茉莉酸。本发明专利技术提供了一种用微生物发酵法产茉莉酸的方法，与化学合成方法相比，具有很大的优势。

Lasiodiplodia iranensis bacteria and method for fermenting and producing jasmonic acid

The invention discloses a method for Lasiodiplodia strain iranensis and its fermentation of jasmonic acid, which belongs to the field of biotechnology. The invention provides a plant can produce jasmonic acid 2 strain DWH, identified by ITS Lasiodiplodia iranensis, the bacteria have been preserved in May 27, 2017 China type culture collection, preservation number of CCTCC NO:M2017288. DWH 2 in solid medium for 4 ~ 5 days, through the fermentation medium static fermentation for 6 to 10 days, can produce jasmonic acid more than 1500mg/L. The invention provides a method for producing jasmonic acid by microbial fermentation, which has great advantages compared with the chemical synthesis method.

【技术实现步骤摘要】
一种Lasiodiplodiairanensis菌及其发酵产茉莉酸的方法
本专利技术涉及一种Lasiodiplodiairanensis菌及其发酵产茉莉酸的方法，属于生物

技术介绍
茉莉酸化学名称3-氧-2-2′-顺-戊烯基-环戊烷-1-乙酸，分子式C12H18O3，分子量210.27。是一种新型的植物激素，在植物的花、茎、叶、根等组织与器官中普遍存在，在植物的生长发育过程中发挥着重要的作用。同时作为第二信号，在植物受到生物与非生物的伤害时诱导激活植物体内的防御基因，抵御外界的伤害。并且因茉莉酸及其甲酯具有清淡、幽雅的香味，所以其可作为很多香花精油主香的成分，广泛的应用于香料业的产生中。在农业生产中，茉莉酸类物质能明显的促进不育植株开花还可以用来提高植物的抗旱性，同时茉莉酸类物质可以诱导植物产生有毒物质、害虫蛋白酶抑制剂等来达到抗虫害的效果，在农业生产中可以用其来代替部分杀虫剂。目前茉莉酸的制备方法主要有三种，从植物中提取、化学合成及微生物发酵法。植物中茉莉酸含量在1-9～10-6g/g，因此，从植物中提取的量少，满足不了当前的需求。化学法根据起始原料不同，分为顺-4-庚烯酸为起始原料、乙酸乙酯为起起始原料、及2-环戊烯-1-乙二醇缩酮和2-甲基-1,3-丁二烯为起始原料的方法，但这些方法的反应收率不高(30％以下)，反应条件苛刻，并且合成的茉莉酸都是外消旋物，限制了其使用的范围。微生物发酵法是通过真菌发酵生产茉莉酸。Aldridge等最早从真菌可可毛色二孢Lasiodiplodiatheobroma培养液中分离出游离的茉莉酸(J.ChemSocChemCoummum.1971,13:1623),这说明某些微生物具有分泌茉莉酸的可能。美国专利US20020110881A1公开了棉色二孢(Diplodiagossypina)发酵产茉莉酸、茉莉酸甲酯及茉莉酸异构体的方法，其中，D.gossypinaATCC10936产茉莉酸浓度可达1.2g/L。国内，韩晓敏等为检测可可毛色二孢菌对白木香产生倍半萜的诱导作用，采用气质联用在其PDA培养液中检测到茉莉酸类化合物(中国中医药杂志，2014，39(2)：192-196)，但其中茉莉酸甲酯含量不高(250mg/L)，同时没有进行相关发酵生产方面的研究。
技术实现思路
本专利技术要解决的第一个技术问题是提供一株LasiodiplodiairanensisDWH-2，可以产生茉莉酸。本专利技术对变质果蔬及玉蕊、拉贡木、海桑、水黄皮、玉米、棉花等植物的腐烂部位上的微生物进行分离，筛选得到分泌茉莉酸的菌株DWH-2，经分子鉴定属于一株L.iranensis菌，其产量明显高于一般野生菌株，通过优化培养基和培养条件进一步提高了产物浓度。所述L.iranensisDWH-2已于2017年5月27日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO：M2017288。所述DWH-2的活化培养，可将菌株接于PDA平板上，放置在25～28℃的培养箱中活化4～5天。所述DWH-2在PDA平板上，菌落生长初期为白色，且日生长量较快，生长到第四天时平板背面开始出现绿色，生长到第六天时培养基开始变成黑色，生长到第九天时培养基完全变成黑色。在电镜下观察，发现该菌的菌丝体有横隔，且为多核。所述DWH-2的ITS基因序列与多株L.iranensis的ITS基因序列相似性达99％～100％，但这些L.iranensis都没有关于产茉莉酸的报道。本专利技术要解决的第二个技术问题是提供一种应用所述L.iranensisDWH-2发酵产茉莉酸的方法。应用所述L.iranensisDWH-2发酵产茉莉酸，是在静止培养状态下进行。包括在20～30℃，静止发酵培养6～10天。用于所述L.iranensisDWH-2发酵产茉莉酸的发酵培养基的碳源包括蔗糖、淀粉、麦芽糖、葡萄糖、果糖中的一种或几种的混合。碳源浓度为25～500g/L。用于所述L.iranensisDWH-2发酵产茉莉酸的发酵培养基的无机氮源包括硝酸钠、尿素、硝酸铵中的一种或几种的混合。无机氮源浓度为3～15g/L。用于所述L.iranensisDWH-2发酵产茉莉酸的发酵培养基的有机氮源包括牛肉膏、蛋白胨、玉米浆、酵母膏、麦芽提取物中的一种或几种的混合。有机氮源浓度为3～15g/L。在本专利技术的一种实施方式中，用于所述L.iranensisDWH-2发酵产茉莉酸的发酵培养基是蔗糖25～500g/L，硝酸钠1～15g/L，磷酸二氢钾0.5～3g/L，氯化钾0.1～0.4g/L，七水硫酸镁1～9g/L，七水硫酸铁0.1～0.9g/L，玉米浆1～5g/L，0.2-20g/L大豆油，微量元素10～12ml/L，pH4.5～8；所述微量元素：七水硫酸铁0.01～0.04g/L，七水硫酸锰0.001～0.004g/L，七水硫酸铜0.001～0.004g/L，二水合钼酸钠0.001～0.004g/L。在应用L.iranensisDWH-2发酵产茉莉酸的过程中，还可以向发酵体系中添加大孔树脂。大孔树脂的型号包括XAD-1、XAD-2、XAD-7HP、AB-8、D101。用量为5～20g/100mL。应用本专利技术提供的L.iranensisDWH-2发酵产茉莉酸，茉莉酸的产量可达到1760mg/L。生物材料保藏LasiodiplodiairanensisDWH-2，已于2017年5月27日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO：M2017288，保藏地址为中国.武汉.武汉大学。附图说明图1TLC产物初步鉴定图图2产物鉴定GC-MS图图3菌株DWH-2的进化树具体实施方式产物分析方法：采用薄层层析(TLC)对产物进行初步定性。参照文献方法，所用的薄层板为GF254，展开剂为：正己烷：乙酸乙酯：醋酸＝60：40：1，显色剂为浓硫酸：甲醇＝1：1用气质联用(GC-MS)对产物进行进一步的鉴定。参照文献方法。气质条件：气相色谱柱AB--5MS30m×0.25mm×0.25μm，载气为氦气，压力为130kg/cm2，分表压力为0.31kg/cm2，流速0.8mL/min。色谱柱采用程序升温，从起始温度50℃以20℃/min升至180℃后保持4min，再以10℃/min升至290℃后保持15min，250℃进样，不分流，进样体积1μL。用HPLC(高效液相色谱)对产物的浓度进行检测，参照文献方法。流动相为甲醇：水：磷酸＝55:44.9：0.1；进样量10～30uL；流速1mL/min；检测器为紫外检测器。实施例1产茉莉酸菌株的筛选与确定发酵培养基：蔗糖25～500g/L，硝酸钠1～15g/L，磷酸二氢钾0.5～3g/L，氯化钾0.1～0.4g/L，七水硫酸镁1～9g/L，七水硫酸铁0.1～0.9g/L，玉米浆1～5g/L，0.2-20g/L大豆油，微量元素10～12ml/L，pH4.5～8。所述微量元素：七水硫酸铁0.01～0.04g/L，七水硫酸锰0.001～0.004g/L，七水硫酸铜0.001～0.004g/L，二水合钼酸钠0.001～0.004g/L。以腐烂的水果及玉蕊、拉贡木、海桑、水黄皮、玉米、棉花等植物的腐烂部位为筛菌材料，将其处理好稀释涂布在本文档来自技高网...

【技术保护点】
Lasiodiplodia iranensis DWH‑2，已于2017年5月27日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2017288，保藏地址为中国武汉大学。

【技术特征摘要】
1.LasiodiplodiairanensisDWH-2，已于2017年5月27日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO：M2017288，保藏地址为中国武汉大学。2.一种应用权利要求1所述L.iranensisDWH-2发酵产茉莉酸的方法，其特征在于，在静止或往复式震荡或旋转式震荡条件下培养。3.根据权利要求2所述的一种应用权利要求1所述L.iranensisDWH-2发酵产茉莉酸的方法，其特征在于，包括在20～30℃，静止发酵培养6～10天。4.根据权利要求2或3所述的一种应用权利要求1所述L.iranensisDWH-2发酵产茉莉酸的方法，其特征在于，发酵培养基的碳源包括蔗糖、淀粉、麦芽糖、葡萄糖、果糖中的一种或几种的混合，碳源浓度为25～500g/L。5.根据权利要求2～4任一所述的一种应用权利要求1所述L.iranensisDWH-2发酵产茉莉酸的方法，其特征在于，发酵培养基的无机氮源包括硝酸钠、尿素、硝酸铵中的一种或几种的混合，无机氮源浓度为3～15g/L。6.根据权利要求2～5任一所述的一种应用权利要求1所述L.iranensisDWH-2发酵产茉莉酸的方法，其特征在于，发酵培养基的有机氮源包括牛肉膏、蛋白胨、玉米浆、酵母膏、麦芽提取物中的一种或...

【专利技术属性】
技术研发人员：郑璞，陈鹏程，董文华，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32