一种提高Vc二步发酵产酸菌生产能力的方法技术

本发明专利技术涉及工业生物发酵领域，具体的说是一种提高Vc二步产酸菌生产能力的方法。将伴生菌在种子培养基中单独培养至稳定末期，所得培养液进行细胞破碎，制成活性蛋白液；将产酸菌的菌悬液，接入内含上述活性蛋白液的发酵培养基中，经发酵获得产酸菌发酵种液；将所述产酸菌发酵种液接入内含上述活性蛋白液的发酵培养基中，进行产酸菌发酵并对山梨糖进行生物转化，至发酵结束获得古龙酸。本发明专利技术方法操作简便、稳定性高、发酵周期短、回收率高、产品质量好、成本低、绿色环保。

Method for improving production capacity of Vc two step fermentation acid producing bacteria

The invention relates to the field of industrial biological fermentation, in particular to a method for improving the production capacity of Vc two step acid producing bacteria. The associated bacteria in the seed culture medium culture alone to a stable end, the medium cells were broken, made of active protein liquid; the acid producing bacteria bacterial suspension containing the active protein liquid fermentation access medium, obtained by Fermentation Lactic acid bacteria fermentation liquid fermentation; the acid producing bacteria the fermentation liquid containing the access active protein liquid medium of acid producing bacteria and fermentation of sorbitol biotransformation to get to the end of fermentation of 2-keto-L-gulonic acid. The method of the invention has the advantages of simple operation, high stability, short fermentation cycle, high recovery rate, good product quality, low cost, and green environment protection.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及工业生物发酵领域，具体的说是一种提高Vc二步产酸菌生产能力的方法。
技术介绍
维生素C(VitaminC,简称Vc)，又称L-抗坏血酸(L-AscorbicAcid)，是一种植物体内常见、人类无法自身合成的维生素。Vc具有多种功能，广泛应用于药品、食品、饲料和化妆品领域，市场需求巨大。Vc二步发酵法是目前工业上制备Vc前体—古龙酸的主要方法。Vc二步发酵系两种菌的混合发酵，一种为产酸菌，通过酶催化山梨糖为古龙酸，俗称“产酸”，但产酸菌自身不能单独培养，需依赖另外一种伴生菌的存在才能生长、繁殖和产酸；另一种为伴生菌，伴生菌不产酸，但可为产酸菌的生长和产酸提供保障。在发酵时两种菌需要混和培养，并且相互间要保持一定的动态平衡，才能较好地完成菌体生长和糖酸转化。但两种菌的生物学特征不同，生长条件和营养需求也不一样。所以，这种产酸菌对伴生菌的高度依赖性同时又伴有较强负面影响，如伴生菌与产酸菌间竞争营养和生态位等，常常使产酸菌的数量和活性受到压制。所以，在培养或发酵时需要同时兼顾两者的各自需求，实现起来十分不易。在实践操作中，往往会顾此失彼，导致产酸菌和伴生菌间生长失衡。因此，该工艺的过程可控性差、批次波动大、整体收率低、生产能力难以进一步提高。所以，处理好两种菌在混和发酵时的相互关系，研发出一种操作简便、安全性高、发酵期短、回收率高、产品质量好、成本低廉、绿色环保的Vc古龙酸发酵新技术，是目前Vc混菌工业发酵领域一个亟待解决的难题。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种提高Vc二步发酵产酸菌生产能力的方法。为实现上述目的，本专利技术采用技术方案为：一种提高Vc二步发酵产酸菌生产能力的方法，包括以下具体步骤：(1)将伴生菌在种子培养基中单独培养至稳定末期，所得培养液进行细胞破碎，制成活性蛋白液；其中，所述菌种细胞破碎的方法包括超声、压榨、研磨或酶解；(2)将产酸菌的菌种悬液，接入内含上述活性蛋白液的发酵培养基中，经发酵获得产酸菌发酵种液；(3)将所述产酸菌发酵种液接入内含上述活性蛋白液的发酵培养基中，进行产酸菌发酵并对山梨糖进行生物转化，至发酵结束获得古龙酸。所述步骤(1)中种子培养基中葡萄糖的质量含量为0.5-1.2％，所述发酵至稳定末期发酵液中伴生菌浓度为1-9×108CFU/ml。所述步骤(2)中产酸菌的菌种悬液接入内含活性蛋白液的发酵培养基的接入量为体积含量的1-15％；所述产酸菌的菌种悬液中，产酸菌的浓度为1-9×109CFU/ml。优选所述步骤(2)中产酸菌的菌种悬液接入内含活性蛋白液的发酵培养基的接入量为体积含量的3-8％；所述产酸菌的菌种悬液中，产酸菌的浓度为4-9×109CFU/ml。所述步骤(2)中，产酸菌的菌种悬液接入内含活性蛋白液的发酵培养基时，所述发酵培养基中活性蛋白液的体积含量为0.2-2.4％，优选为1.2％。所述步骤(3)中产酸菌的菌种悬液接入内含活性蛋白液的发酵培养基的接入量为体积含量的2-10％，优选为5％；所述产酸菌的发酵种液中，产酸菌的浓度为1-9×109CFU/ml。所述步骤(3)中，所述发酵培养基中活性蛋白液的体积含量为0.2-1.2％，优选为0.5％。所述步骤(3)中，在发酵中期时补加发酵培养基体积含量0.05-0.5％的活性蛋白液；优选补加体积含量为0.1-0.3％的活性蛋白液。所述伴生菌选自巨大芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、掷孢酵母或啤酒酵母中的一种或几种；所述产酸菌选自生酮基古龙酸菌。本专利技术的优点在于：本专利技术方法具备单菌种(即产酸菌)发酵的特征，可极大地提高发酵过程的可控性和生产效率，有着操作简便、安全性高、收率高、发酵周期短、产品质量好、成本低、绿色环保等优点，适合在Vc发酵制备古龙酸的工业生产领域中应用；具体为：(1)本专利技术改变Vc二步双菌种混合发酵为单菌种发酵，排除产酸菌种对伴生菌的过度依赖。(2)本专利技术中产酸菌和伴生菌各自单独培养，排除混合培养时之间的干扰，最大程度地满足各自的最佳需求，保障了活性蛋白的充足供应，使新种液质量得到大幅提升，保障发酵的快速启动及后续的高效进行。(3)本专利技术发酵过程中的管理和调节得以规范化和简便化，生产得以稳定、高效进行。具体实施方式以下实施例将有助于对本专利技术的了解，但这些实施例仅为了对本专利技术加以说明，本专利技术并不限于这些内容。下述各实施例中的发酵条件，无需特殊限定，按照现阶段通用的Vc发酵条件即可。实施例1(1)选取5L发酵罐，注入3L葡萄糖质量含量为0.5％的种子培养基，接入150ml浓度为2×108CFU/ml的巨大芽孢杆菌悬液作为伴生菌，发酵至稳定末期，伴生菌浓度达3.6×108CFU/ml，再以25KHz超声破碎得活性蛋白液。(2)取100ml上述活性蛋白液，接入内含15L发酵培养基的20L发酵罐中，再接入400ml菌浓度为3×109CFU/ml的产酸菌悬液(产酸菌为生酮基古龙酸菌)，发酵至菌浓度达4.5×109CFU/ml，得到产酸菌发酵种液。(3)取上述产酸菌发酵种液15L接入内含300L发酵培养基及1.5L上述步骤(1)所获活性蛋白液的500L发酵罐，对山梨糖进行发酵至发酵结束，在发酵醪液中获得古龙酸。在同等条件下，采用实施例1的Vc二步单菌种发酵制备古龙酸的方法与传统的Vc二步混菌发酵法相比，古龙酸收率提高2个百分点，即收率为93％，发酵周期缩短6％。实施例2(1)选取5L发酵罐，注入3L葡萄糖质量含量为0.5％的种子培养基，接入150ml菌浓度为2×108CFU/ml的巨大芽孢杆菌悬液作为伴生菌，发酵至稳定末期，伴生菌浓度达3.6×108CFU/ml。25KHz超声破碎得活性蛋白液。(2)取100ml上述获得活性蛋白液，接入内含15L发酵培养基的20L发酵罐，再接入400ml菌浓度为3×109CFU/ml的产酸菌悬液(产酸菌为生酮基古龙酸菌)，发酵至菌浓度达4.5×109CFU/ml，得到产酸菌发酵种液。(3)取上述产酸菌发酵种液15L接入内含300L发酵培养基及1.5L上述步骤(1)获得的活性蛋白液的500L发酵罐对山梨糖进行发酵，发酵20小时至发酵中期，再补加500ml上述步骤(1)获得的活性蛋白液，至发酵结束，在发酵醪液中获得古龙酸。在同等条件下，采用实施例二的Vc二步单菌种发酵制备古龙酸的方法与传统的Vc二步混菌发酵法相比，古龙酸收率提高2.6个百分点，即收率为93.6％，发酵周期缩短8％。实施例3(1)选取5L发酵罐，注入3L葡萄糖质量含量为0.6％的种子培养基，接入200ml浓度为3×108CFU/ml的蜡状芽孢杆菌悬液作为伴生菌，发酵至稳定末期，伴生菌浓度达5.5×108CFU/ml。25KHz超声破碎得活性蛋白液。(2)取100ml上述获得的活性蛋白液，接入内含15L发酵培养基的20L发酵罐，再接入400ml浓度为2.5×109CFU/ml的产酸菌悬液(产酸菌为生酮基古龙酸菌)，发酵至菌浓度达4×109CFU/ml，得到产酸菌发酵种液。(3)取上述产酸菌发酵种液15L接入内含300L发酵培养基及1.5L上述步骤(1)获得的活性蛋白液的500L发酵罐，对山梨糖进行发酵至结束，得到古龙酸。在同等条件下，采用实施例三的Vc二本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种提高Vc二步发酵产酸菌生产能力的方法，其特征在于：(1)将伴生菌在种子培养基中单独培养至稳定末期，所得培养液进行细胞破碎，制成活性蛋白液；(2)将产酸菌的菌种悬液，接入内含上述活性蛋白液的发酵培养基中，经发酵获得产酸菌发酵种液；(3)将所述产酸菌发酵种液接入内含上述活性蛋白液的发酵培养基中，进行产酸菌发酵并对山梨糖进行生物转化，至发酵结束获得古龙酸。

【技术特征摘要】
1.一种提高Vc二步发酵产酸菌生产能力的方法，其特征在于：(1)将伴生菌在种子培养基中单独培养至稳定末期，所得培养液进行细胞破碎，制成活性蛋白液；(2)将产酸菌的菌种悬液，接入内含上述活性蛋白液的发酵培养基中，经发酵获得产酸菌发酵种液；(3)将所述产酸菌发酵种液接入内含上述活性蛋白液的发酵培养基中，进行产酸菌发酵并对山梨糖进行生物转化，至发酵结束获得古龙酸。2.根据权利要求1所述的提高Vc二步发酵产酸菌生产能力的方法，其特征在于：所述步骤(1)中种子培养基中葡萄糖的质量含量为0.5-1.2％，所述发酵至稳定末期发酵液中伴生菌浓度为1-9×108CFU/ml。3.根据权利要求1所述的提高Vc二步发酵产酸菌生产能力的方法，其特征在于：所述步骤(2)中产酸菌的菌种悬液接入内含活性蛋白液的发酵培养基的接入量为体积含量的1-15％；所述产酸菌的菌种悬液中，产酸菌的浓度为1-9×109CFU/ml。4.根据权利要求1或3所述的提高Vc二步发酵产酸菌生产能力的方法，其特征在于：...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐慧，杨伟超，吕淑霞，张忠泽，
申请(专利权)人：中国科学院沈阳应用生态研究所，
类型：发明
国别省市：辽宁;21