一种麦芽糖淀粉酶及其基因、含有该基因的工程菌及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种麦芽糖淀粉酶及其基因、含有该基因的工程菌及其应用。本发明专利技术提供了一种产超高纯度麦芽糖的麦芽糖淀粉酶基因，其核苷酸序列为：SEQ ID NO.1所编码的麦芽糖淀粉酶氨基酸序列为：SEQ ID NO.2。利用该基因构建的毕赤酵母工程菌株能高效表达麦芽糖淀粉酶，该麦芽糖淀粉酶能高效的水解淀粉产生超高纯度麦芽糖，麦芽糖含量达90％以上，且水解终产物中不含葡萄糖。该酶以可溶性淀粉为底物时其比活力高达980U/mg。利用基因生产的酶制剂可用于食品、冷冻食品、烘焙、酿造、饮料工业和医药等行业，在解决实际问题的同时还可以取得可观的经济效益。

Maltose amylase and its gene, engineering bacterium containing the gene and application thereof

The present invention discloses maltose amylase and its gene, engineering bacterium containing same and application thereof. The invention provides a method for producing high purity maltose maltose amylase gene, the nucleotide sequence is: maltose amylase amino acid sequence of SEQ ID NO.1 encoding: SEQ ID NO.2. The use of Pichia pastoris strain of the gene construct highly expressed maltose amylase hydrolyzed starch, the maltose amylase can efficiently produce high purity maltose, maltose content reaches above 90%, and the final product does not contain glucose hydrolysis. The enzyme exhibited a specific activity of up to 980U/mg when soluble starch was used as substrate. The enzymes used in gene production can be used in food, frozen food, baking, brewing, beverage and pharmaceutical industries, and can achieve considerable economic benefits while solving practical problems.

【技术实现步骤摘要】
一种麦芽糖淀粉酶及其基因、含有该基因的工程菌及其应用
本专利技术属于应用工业微生物领域，公开了一种麦芽糖α-淀粉酶基因、含有该基因的工程菌及其应用。
技术介绍
淀粉作为地球上含量最为丰富的聚合物之一，是由葡萄糖单体单元以葡萄糖苷键连接而成的，根据糖苷键的区别分为两种重要组分：直链淀粉(线性α-1,4键连接的葡聚糖)和支链淀粉(线性α-1,4键连接的葡聚糖上连有α-1,6键的支链)，占总糖苷键的6％左右的α-1,6键使得淀粉糖链形成了分支结构。淀粉水解能够为不同的生命体提供能量，同时其水解产物还被广泛的应用于人类生活的各个方面。在淀粉的水解物中有一种常见的组成成分—麦芽糖(Maltose)，麦芽糖为两个葡萄糖单位经过α-1，4糖苷键结合的还原性二糖，分子式C12H22O11，化学名称为4-O-α-D-吡喃葡糖基-D-葡萄糖，分子量342.30，因Cl羟基的位置不同而有α-和β-两种异构体，结构式如下所示：游离的麦芽糖不存在于自然界中，只能通过淀粉水解产生。麦芽糖糖浆由于一些突出优点,如营养价值高，甜味温和、甜度只有蔗糖的1/3，且不参加胰岛素代谢,粘度低,吸潮性低，结晶性低，耐高温，清凉透明。其在冷冻食品、烘焙、酿造和饮料工业的应用方面具有很高的商业价值，尤其是高纯度的麦芽糖在医药工业有着重要的用途。麦芽糖糖浆按其中麦芽糖含量可以分为三类：一是麦芽糖含量＜50％为普通麦芽糖糖浆；二是麦芽糖含量50-75％之间为高麦芽糖糖浆；三是麦芽糖含量＞80％则为超高麦芽糖糖浆。目前国内市场的麦芽糖产品，以饴糖、高麦芽糖浆为主，也有超高麦芽糖浆产品，但是超高纯度麦芽糖和结晶麦芽糖产品很少。生麦芽糖α-淀粉酶(EC3.2.1.133，maltogenicα-amylase)，全称1,4-α-D-葡聚糖-α-麦芽糖基水解酶，俗称麦芽糖淀粉酶，是α-淀粉酶家族中作用于淀粉及相关多聚糖以麦芽糖单位从淀粉链的非还原末端按顺时针方向被水解下来,主产物为α-麦芽糖的一类酶，属于糖苷水解酶家族GH13。麦芽糖淀粉酶性质非常独特，不同于典型的淀粉酶随机切割淀粉中的α-1,4键糖苷键，它不但可快速水解利用直链淀粉或环状糊精，也能少量利用支链淀粉，具有多底物特性；而且还具有一定程度的转糖基作用。不同来源的麦芽糖淀粉酶在产麦芽糖能力以及酶学特性等方面也存在差异。来源于Penicilliumexpansum高产麦芽糖淀粉酶，分子量为69kDa，最适pH4.5，在pH3.6-6范围内保持稳定，最适温度为60℃，水解淀粉产物中麦芽糖含量高达74％，但同时有21％的葡萄糖产生。来源于Streptomycessp.IMD2679的高产麦芽糖的淀粉酶最适pH为5.5，最适温度为60-65℃，以可溶性淀粉为底物的比活力为3042U/mg，水解产物中麦芽糖含量高达79％，但同时伴随着13％的葡萄糖产生。来源于RhizopusoryzaeCICIM0071产麦芽糖淀粉酶分子量为48kDa，最适pH为4.0-6.0，在4.5-6.5范围保持稳定，最适温度为60℃，低于50℃保持稳定。以可溶性淀粉为底物的比活力为1123U/mg，水解土豆淀粉产得到的麦芽糖含量高达74％，其中水解产物中葡萄糖含量为14％。来源于ThermomonosporacurvataNCIMB10081的麦芽糖淀粉酶以可溶性淀粉为底物时的比活力为5400U/mg，该蛋白分子量约62kDa，最适pH为6.0，最适温度为65℃，麦芽糖含量高达73％，水解过程中不产生葡萄糖，但有大量麦芽三糖残留。该蛋白水解淀粉产生的麦芽糖含量达到最高时需要20h，同时在以20mM麦芽三糖为底物时，反应30min后麦芽糖含量只有10％，说明该蛋白在高产麦芽糖的同时表现出较低的催化效率。随着人们对麦芽糖质量要求的进一步提高,对麦芽糖淀粉酶这样一种具有重要工业应用价值的新型酶制剂的研究已成为热点。国外对麦芽糖淀粉酶进行了大量的研究，几家大型酶制剂公司如诺维信、丹尼斯克等，已有麦芽糖淀粉酶面世，但价格昂贵。国内对麦芽糖淀粉酶的研究还处于初级阶段，因此国内目前使用的麦芽糖淀粉酶基本依赖进口。目前的麦芽糖生产是将淀粉通过真菌淀粉酶和β-淀粉酶处理,产生由葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖、四糖等麦芽低聚糖以及多糖组成的普通麦芽糖浆。要得到高麦芽糖浆,还要再添加脱支酶和β-淀粉酶共同作用,或用葡萄糖淀粉酶等对普通麦芽糖浆进行后处理。由于这些生产过程中都存在葡萄糖、麦芽三糖、四糖等低聚麦芽寡糖等副产物,严重影响其麦芽糖质量，使得酶法制备的麦芽糖纯度难以达到超高麦芽糖浆的要求，因此需要后续工艺进一步去除葡萄糖，这就为生产过程额外的增加了成本，限制了蛋白的应用范围。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种新的麦芽糖淀粉酶基因，及其编码的蛋白质。本专利技术的另一目的是提供含有该麦芽糖淀粉酶基因的基因工程菌株。本专利技术的又一目的是提供该基因及其编码蛋白质的应用。一种麦芽糖淀粉酶基因，其核苷酸序列为：SEQIDNO.1，全长(从起始密码子到终止密码子)为1665bp，G+C含量为69.19％，编码554个氨基酸。本专利技术所述的麦芽糖淀粉酶基因编码的麦芽糖淀粉酶蛋白质,其氨基酸序列为：SEQIDNO.2。本专利技术所述的麦芽糖淀粉酶最适反应pH为7.0，最适反应温度为50℃，并在20℃-40℃(5h)和pH6.0-9.0(24h)之间保持活性稳定，且酶活不依赖Ca2+离子。在以淀粉为底物时产生超高麦芽糖，麦芽糖含量可以高达90％以上，且水解终产物不含有葡萄糖。含本专利技术所述麦芽糖淀粉酶基因的重组质粒。所述的重组质粒优选将所述麦芽糖淀粉酶基因克隆到pEFaA中所得。含本专利技术所述的重组质粒的重组微生物。所述的重组微生物，优选以毕赤酵母(PichiapastorisGS115)为宿主菌。本专利技术所述麦芽糖淀粉酶蛋白质在淀粉水解或超高麦芽糖工业生产及食品加工方面的应用。本专利技术所述麦芽糖淀粉酶蛋白质联合α-1,4淀粉酶内切酶在产超高麦芽糖中的应用。所述的α-1,4淀粉酶内切酶优选专利申请号为“201310043628.5”(国际申请号为PCT/CN2013/078680)，名称为“一种α-淀粉酶及其基因、含有该基因的工程菌及其应用”中保护的α-1,4淀粉酶内切酶。该α-1,4淀粉酶内切酶的编码基因如该专利序列表SEQIDNO.1所示，其氨基酸序列如该专利序列表SEQIDNO.2所示。表达方法、酶学性质、功能在该专利中已公开，详见该专利的公开文本。有益效果1.本专利技术以粘细菌菌株EGB为材料，参考EGB基因组序列信息并结合PCR扩增，成功获得麦芽糖淀粉酶基因序列。该基因全长(从起始密码子到终止密码子)为1665bp，G+C含量为69.19％，编码554个氨基酸。2.通过PCR技术扩增末端含XhoI和XbaI酶切位点的完整的麦芽糖淀粉酶基因片段，将它连接到毕赤酵母P.pastorisGS115高表达载体pEFaA(购自Novegen公司)的XhoI和XbaI酶切位点上，转化表达宿主菌P.pastorisGS115(购自Invitrogen公司)，进行甲醇诱导表达，诱导表达量为64mg/L。3.本专利技术对麦芽糖淀粉酶基因表达的产物，通过DNS方法对麦芽糖淀粉酶进行酶活性测定，该麦本文档来自技高网...

【技术保护点】
麦芽糖淀粉酶基因，其特征在于核苷酸序列为：SEQ ID NO.1。

【技术特征摘要】
1.麦芽糖淀粉酶基因，其特征在于核苷酸序列为：SEQIDNO.1。2.权利要求1所述的麦芽糖淀粉酶基因编码的麦芽糖淀粉酶蛋白质,其氨基酸序列为：SEQIDNO.2。3.含权利要求1所述麦芽糖淀粉酶基因的重组质粒。4.根据权利要求3所述的重组质粒，其特征在于所述的重组质粒是将权利要求1所述麦芽糖淀粉酶基因克隆到pEFaA中所得。5.含权利要求3所述的重组质粒的重组微生物。6.根据权利要求5所述的重组微生物，其特征在于以毕赤酵母GS115为宿主菌。7.权利要求1所述的麦芽糖淀粉酶基因在产超高麦芽糖方面的基因工程应用；所述的...

【专利技术属性】
技术研发人员：崔中利，周杰，李周坤，吴佳乐，黄彦，
申请(专利权)人：南京农业大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32