一种毛囊干细胞的制备方法技术

本发明专利技术属于生物化学技术领域，尤其涉及一种毛囊干细胞的制备方法。本发明专利技术提供了一种毛囊干细胞的制备方法，为：步骤一、收集尿液细胞；步骤二、尿液细胞重编程；步骤三、诱导多功能细胞诱导培养；步骤四、间充质干细胞诱导培养，得毛囊干细胞。通过本发明专利技术提供的技术方案制得的毛囊干细胞，毛囊干细胞的阳性标志物CK15在多数毛囊组织来源的铺路石样细胞中呈阳性表达；同时，通过流式细胞仪分析显示，在毛囊干细胞中CK15、CK19、CD200、β1表达为阳性，符合毛囊干细胞表面标记物的表达结果。本发明专利技术提供的一种毛囊干细胞的制备方法，解决了现有技术中，毛囊干细胞的制备方法存在着：原材料获得困难以及无法满足伦理学要求的技术缺陷。

Method for preparing hair follicle stem cell

The invention belongs to the technical field of Biochemistry, in particular to a preparation method of a hair follicle stem cell. The present invention provides a method for preparing hair follicle stem cells as a step to collect urine cells; step two, urine cell reprogramming; step three, induced pluripotent cells in vitro; step four, mesenchymal stem cells induced and cultured to hair follicle stem cells. Cells provided by the technical scheme of the invention are made of hair follicle stem, hair follicle stem positive markers of the cells showed CK15 positive expression in the majority of hair follicle tissue derived cobblestone like cells; at the same time, through the flow cytometry analysis showed that the hair follicle stem cells CK15, CK19, CD200, beta 1 expression was positive the result is consistent with the expression of hair follicle stem cell surface markers. The present invention provides a method for preparing hair follicle stem cell, and solves the technical defects in the prior art that the preparation method of hair follicle stem cell is difficult to obtain raw material and can not meet the technical requirement of ethics.

【技术实现步骤摘要】
一种毛囊干细胞的制备方法
本专利技术属于生物化学
，尤其涉及一种毛囊干细胞的制备方法。
技术介绍
皮肤是人体中表面积最大的器官，在抵御微生物入侵，紫外线辐射以及防止水分的丢失、调节体温方面起重要作用，当皮肤组织遭到缺损，传统的治疗方法是自体断层皮片移植，但存在供皮量有限和造成额外损伤的障碍。利用体外培养的人工皮肤即组织工程皮肤作为移植的来源可以从根本上解决这个问题，但是如何获得种子细胞却一直困扰着人们。随着医学生物学的发展，皮肤组织工程的深入，毛囊干细胞作为一种新的种子细胞逐渐受到人们的关注，越来越多的研究表明，毛囊干细胞存在具有多向分化的潜能。然而，现有技术中，毛囊干细胞的制备方法存在着：获得困难以及无法满足伦理学要求的技术缺陷。因此，研发出一种毛囊干细胞的制备方法，用于解决现有技术中，毛囊干细胞的制备方法存在着原材料获得困难以及无法满足伦理学要求的技术缺陷，成为了本领域技术人员亟待解决的问题。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术提供了一种毛囊干细胞的制备方法，用于解决现有技术中，毛囊干细胞的制备方法存在着原材料获得困难以及无法满足伦理学要求的技术缺陷。本专利技术提供了一种毛囊干细胞的制备方法，所述制备方法为：步骤一、收集尿液细胞；步骤二、尿液细胞重编程：表达转录调控因子导入尿液细胞后，在培养基中培养，得诱导多功能细胞；步骤三、诱导多功能细胞诱导培养：所述诱导多功能细胞消化后，培养至融合度大于70％后进行诱导培养，形变得间充质干细胞；步骤四、间充质干细胞诱导培养；所述间充质干细胞消化后，培养至融合度大于80％后进行诱导培养，形变得毛囊干细胞。优选地，所述毛囊干细胞的制备方法还包括：步骤五、毛囊干细胞的扩增：毛囊干细胞于培养液E中培养；所述培养液E包括：DMEM基础培养基、FBS、0.001～0.1％T-β、1～100ng/mLhEGF、1-100ng/mLVEGF以及1～10mmol/LL-谷氨酰胺；其中，DMEM基础培养基与FBS的体积比为9:1。优选地，步骤一所述尿液细胞的收集方法为：尿液与青霉素/链霉素双抗混合后离心弃上清液后，再与含有青霉素/链霉素的PBS溶液混合后离心弃上清液，将剩余液体置于0.1％明胶包被的孔中，加入含PrimocinREGM培养基进行培养。优选地，步骤一所述尿液细胞的融合度大于80％。优选地，步骤二所述表达转录调控因子选自：OCT4、SOX2、NANOG、KLF4以及LIN28中的一种或多种。优选地，步骤二所述尿液细胞重编程的方法为：表达转录调控因子导入尿液细胞后，用培养液A培养一天后，更换培养基为IPS培养基mTesR培养六天后，挑选与人胚胎干细胞形态相近的单克隆，所述单克隆接种于matrigel包被的培养环境中，培养基mTesR培养得多功能细胞；所述培养液A包括：REGM与MEF。优选地，步骤三所述多功能细胞诱导培养的方法为：所述诱导多功能细胞融合度消化后，培养至融合度大于70％后，加入培养液B培养至细胞发生形变后，更换培养液C进行培养，得间充质干细胞；所述培养液B包括：DMEM基础培养基、FBS、1～160pM胰岛素、1～10mML-谷氨酰胺、50～200ug/LbFGF、5～50ug/LSCF以及2～5×10-8mol/L地塞米松，其中，DMEM基础培养基与FBS的体积比为9:1；所述培养液C包括：DMEM基础培养基、FBS、1～100ng/mLhEGF、1～100ng/mLbFGF、1～50ng/mLHGF、、2～20ng/mLPDGF以及1～25ng/mLTGF-β，其中，DMEM基础培养基与FBS的体积比为9:1。优选地，培养液B的培养时间为5～7天。优选地，所述间充质干细胞消化后，培养至融合度大于80％后，加入培养液D培养，得毛囊干细胞；所述培养液D包括：DMEM基础培养基、FBS、1～115ng/mLhEGF、0.05～100ng/mLIGF、0.01～10ug/L氢化可的松、1～150ng/mL亚油酸、0.5～10ug/mLHGF、30～200ng/mLWnt3a以及10～65ug/mLKGF-7，其中，，DMEM基础培养基与FBS的体积比为9:1。优选地，培养液D的培养时间为7～8天。综上所述，本专利技术提供了一种毛囊干细胞的制备方法，所述制备方法为：步骤一、收集尿液细胞；步骤二、尿液细胞重编程：表达转录调控因子导入尿液细胞后，在培养基中培养，得诱导多功能细胞；步骤三、诱导多功能细胞诱导培养：所述诱导多功能细胞消化后，培养至融合度大于70％后进行诱导培养，形变得间充质干细胞；步骤四、间充质干细胞诱导培养；所述间充质干细胞消化后，培养至融合度大于80％后进行诱导培养，形变得毛囊干细胞。通过本专利技术提供的技术方案制得的毛囊干细胞，毛囊干细胞的阳性标志物CK15在多数毛囊组织来源的铺路石样细胞中呈阳性表达；同时，通过流式细胞仪分析显示，在毛囊干细胞中CK15、CK19、CD200、β1表达为阳性，符合毛囊干细胞表面标记物的表达结果。本专利技术提供的一种毛囊干细胞的制备方法，解决了现有技术中，毛囊干细胞的制备方法存在着原材料获得困难以及无法满足伦理学要求的技术缺陷。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。图1为本专利技术实施例中，一种毛囊干细胞的制备方法的流程示意图；图2为本专利技术实施例提供的一种毛囊干细胞的制备方法中，所制得的毛囊干细胞表面标记物流式检测结果图。具体实施方式本专利技术实施例提供了一种毛囊干细胞的制备方法，用于解决现有技术中，毛囊干细胞的制备方法存在着获得原材料困难以及无法满足伦理学要求的技术缺陷。下面将对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。为了更详细说明本专利技术，下面结合实施例对本专利技术提供的一种毛囊干细胞的制备方法，进行具体地描述。实施例1培养基A：REGM与MEF培养基按体积比为1：1混合。培养基B：450mLDMEM基础培养基、50mLFBS、80pM胰岛素、5mML-谷氨酰胺、85ug/LbFGF、15ug/LSCF以及3×10-8mol/L地塞米松。培养基C：450mLDMEM基础培养基、50mLFBS、10ng/mLhEGF、10ug/LbFGF、3ng/mLHGF、5ng/mLPDGF以及5ng/mLTGF-β。培养基D：450mLDMEM基础培养基、50mLFBS、15ng/mLhEGF、10ng/mLIGF、0.5ug/L氢化可的松、100ng/mL亚油酸、4ug/mLHGF、150ng/mLWnt3a以及13ug/mLKGF-7。培养基E：450mLDMEM基础培养基、50mLFBS、0.015％T-β、10ng/mLhEGF、10ng/mlVEGF以及2.5mmol/LL-谷氨酰胺。步骤一、收集尿液细胞1)收集杯每个加2mL青霉素/本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种毛囊干细胞的制备方法，其特征在于，所述制备方法为：步骤一、收集尿液细胞；步骤二、尿液细胞重编程：表达转录调控因子导入尿液细胞后，在培养基中培养，得诱导多功能细胞；步骤三、诱导多功能细胞诱导培养：所述诱导多功能细胞消化后，培养至融合度大于70％后进行诱导培养，形变得间充质干细胞；步骤四、间充质干细胞诱导培养；所述间充质干细胞消化后，培养至融合度大于80％后进行诱导培养，形变得毛囊干细胞。

【技术特征摘要】
1.一种毛囊干细胞的制备方法，其特征在于，所述制备方法为：步骤一、收集尿液细胞；步骤二、尿液细胞重编程：表达转录调控因子导入尿液细胞后，在培养基中培养，得诱导多功能细胞；步骤三、诱导多功能细胞诱导培养：所述诱导多功能细胞消化后，培养至融合度大于70％后进行诱导培养，形变得间充质干细胞；步骤四、间充质干细胞诱导培养；所述间充质干细胞消化后，培养至融合度大于80％后进行诱导培养，形变得毛囊干细胞。2.根据权利要求1所述的毛囊干细胞的制备方法，其特征在于，所述毛囊干细胞的制备方法还包括：步骤五、毛囊干细胞的扩增：毛囊干细胞于培养液E中培养；所述培养液E包括：DMEM基础培养基、FBS、0.001～0.1％T-β、1～100ng/mLhEGF、1-100ng/mLVEGF以及1～10mmol/LL-谷氨酰胺；其中，DMEM基础培养基与FBS的体积比为9:1。3.根据权利要求1所述的毛囊干细胞的制备方法，其特征在于，步骤一所述尿液细胞的收集方法为：尿液与青霉素/链霉素双抗混合后离心弃上清液后，再与含有青霉素/链霉素的PBS溶液混合后离心弃上清液，将剩余液体置于0.1％明胶包被的孔中，加入含PrimocinREGM培养基进行培养。4.根据权利要求1所述的毛囊干细胞的制备方法，其特征在于，步骤一所述尿液细胞的融合度大于80％。5.根据权利要求1所述的毛囊干细胞的制备方法，其特征在于，步骤二所述表达转录调控因子选自：OCT4、SOX2、NANOG、KLF4以及LIN28中的一种或多种。6.根据权利要求1所述的毛囊干细胞的制备方法，其特征在于，步骤二所述尿液细胞重编程的方法为：表达转录调控因子导入尿液细胞后，用培养液A培养一天后，更换培养基为IPS培养基mTesR培养六天后，挑选与人...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄燕飞，车七石，刘少辉，
申请(专利权)人：广州润虹医药科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44