本发明专利技术公开了一种稳定表达人心肌细胞Iks的细胞模型及其建立方法与应用。该细胞模型为CHOK1-KCNQ1/KCNE1细胞系，构建方法是以CHO-K1细胞为宿主细胞，将KCNQ1基因编码的α亚基单位和KCNE1基因编码的β亚基单位转染入CHO-K1细胞中。本发明专利技术通过将组成Iks通道的KCNQ1基因编码的α亚基单位和KCNE1基因编码的β亚基单位共同转染到CHO-K1细胞中，建立了体外稳定表达KCNQ1/KCNE1细胞模型，为药物的体外高通量筛选提供了一种新的有效途径。
Cell model for stably expressing human cardiac muscle cell Iks and its establishment method and Application
The invention discloses a cell model for stably expressing human cardiac muscle cell Iks and a method for establishing the same and an application thereof. The cell model is a CHOK1-KCNQ1/KCNE1 cell line, and the construction method uses CHO-K1 cells as host cells to transfect the subunit subunit of the KCNQ1 gene encoding the subunit subunit of the KCNE1 gene encoding into the CHO-K1 cell. The present invention by alpha subunit and KCNE1 gene encoding KCNQ1 gene encoding the composition of Iks channel of the Yaji unit co transfected into CHO-K1 cells, an in vitro stable expression of KCNQ1/KCNE1 cell model, and provides a new approach for high-throughput drug screening in vitro.
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及体外高通量药物筛选领域，特别是涉及一种稳定表达人心肌细胞Iks的CHOK1细胞模型及其建立方法与应用。
技术介绍
离子通道是细胞膜上的蛋白质孔道,离子的跨膜流动是细胞传递信息的基础。钾通道是一类普遍存在的膜蛋白,在很多的生理过程中扮演着极为重要的角色。缓慢激活延迟整流钾电流（Iks）对于控制心脏电生理活动有着重要作用，参与人心肌细胞动作电位复极，特别是平台期形成与维持的重要外向离子流。Iks通道是由KCNQ1基因编码的α亚基单位，以及KCNE1基因编码的β亚基单位组成的。IKs其亚基上的基因突变，会引起Iks功能异常，是多种恶性心律失常的重要原因，深入研究Iks通道特性、药理特性及其调节机制将可能为此类心律失常的防治提供新线索。由于人心肌细胞Iks电流密度小，存在多种电流成分干扰，以及组织标本来源困难等原因，直接利用人心肌细胞对药物的高通量筛选来说不是最佳选择，因此建立体外的稳定表达的Iks细胞模型具有很大的价值，有利于药物的稳定高效筛选。中国仓鼠卵巢细胞（CHO-K1）是来源于中国仓鼠卵巢的细胞系，应用于生物和医学研究以及应用于商业化的治疗蛋白的生产。CHO-K1细胞作为生物制药生产的主要宿主细胞，具有高增长率，高产率，易于遗传操作，本身表面离子通道少，干扰少等特点，所以更适用于表达外源离子通道蛋白，用于药物筛选。电生理方法筛选阳性的离子通道克隆以及进行药物筛选，是检测离子通道是否在细胞表面表达且发挥功能的标准方法。传统的手动膜片钳技术虽然能够很好的研究细胞表面离子通道的作用，但是其人力资源耗费大，且通量小，效率低，不能进行大量的克隆筛选以及药物化合物的筛选，所以很难成为细胞克隆初期筛选的最好的实验方法。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题之一是提供一种稳定表达人心肌细胞Iks的细胞模型，它有利于药物的稳定高效筛选。为解决上述技术问题，本专利技术的稳定表达人心肌细胞Iks的细胞模型，以CHO-K1细胞为宿主细胞，包含有KCNQ1基因编码的α亚基单位和KCNE1基因编码的β亚基单位。本专利技术要解决的技术问题之二是提供上述细胞模型的建立方法。为解决上述技术问题，本专利技术的稳定表达人心肌细胞Iks的细胞模型的建立方法，步骤包括：将KCNQ1和KCNE1质粒分别连接到载体上，然后转染入CHO-K1细胞。本专利技术要解决的技术问题之三是提供上述细胞模型在药物体外高通量筛选中的应用。与现有技术相比，本专利技术具有以下优点和有益效果：1．本专利技术通过将组成Iks通道的KCNQ1基因编码的α亚基单位以及KCNE1基因编码的β亚基单位共同转染到CHO-K1细胞中，在细胞内共表达，发挥通道功能，成功建立了体外稳定表达KCNQ1/KCNE1的CHOK1细胞模型，对进行体外药物高通量筛选带来了许多便利。2．本专利技术使用膜电位试剂盒，通过FLIPR检测荧光信号值，能够快速、高效地筛选表达通道且有通道功能的阳性克隆，为电生理实验提供更有针对性的克隆“候选者”，从而节省了大量的时间和人力，是一种很好的高通量筛选途径。附图说明图1是FLIPR检测得到的反应信号图。图2是手动膜片钳在CHOK1-KCNQ1/KCNE1细胞上记录到的CHOK1/KCNQ1原始电流图。图3是手动膜片钳记录到的KCNQ1/KCNE1通道的电流-电压关系曲线。图4是在手动膜片钳验证中，KCNQ1/KCNE1通道的选择性抑制剂Chromanol（色原烷醇）抑制了KCNQ1/KCNE1通道的电流。具体实施方式为对本专利技术的
技术实现思路
、特点与功效有更具体的了解，现结合图示的实施方式，详述如下：实施例1（一）质粒载体构建1．全基因合成KCNQ1和KCNE1，在基因5’末端引入酶切位点EcoRI，3’末端引入酶切位点HindIII。2．在50μl的反应体系中，37℃，用EcoRI和HindIII，双酶切KCNQ1、KCNE1和载体pFastBac1-pCDNA3.1(-)3小时。3．在20μl的反应体系中，16℃，用T4连接酶把KCNQ1和KCNE1分别连接到载体pFastBac1-pCDNA3.1(-)上。4．连接产物分别转化到Top10感受态细菌中，均匀涂在含有氨苄青霉素的LB（Luria-Bertani）培养基平板上，37摄氏度培养14小时后，挑单克隆进行菌落PCR（20μl的反应体系，94℃变性，58℃退火，72℃延伸，30个循环）鉴定，并测序阳性克隆。测序结果：KCNQ1mRNA序列(2031bp)：ATGGCCGCGGCCTCCTCCCCGCCCAGGGCCGAGAGGAAGCGCTGGGGTTGGGGCCGCCTGCCAGGCGCCCGGCGGGGCAGCGCGGGCCTGGCCAAGAAGTGCCCCTTCTCGCTGGAGCTGGCGGAGGGCGGCCCGGCGGGCGGCGCGCTCTACGCGCCCATCGCGCCCGGCGCCCCAGGTCCCGCGCCCCCTGCGTCCCCGGCCGCGCCCGCCGCGCCCCCAGTTGCCTCCGACCTTGGCCCGCGGCCGCCGGTGAGCCTAGACCCGCGCGTCTCCATCTACAGCACGCGCCGCCCGGTGTTGGCGCGCACCCACGTCCAGGGCCGCGTCTACAACTTCCTCGAGCGTCCCACCGGCTGGAAATGCTTCGTTTACCACTTCGCCGTCTTCCTCATCGTCCTGGTCTGCCTCATCTTCAGCGTGCTGTCCACCATCGAGCAGTATGCCGCCCTGGCCACGGGGACTCTCTTCTGGATGGAGATCGTGCTGGTGGTGTTCTTCGGGACGGAGTACGTGGTCCGCCTCTGGTCCGCCGGCTGCCGCAGCAAGTACGTGGGCCTCTGGGGGCGGCTGCGCTTTGCCCGGAAGCCCATTTCCATCATCGACCTCATCGTGGTCGTGGCCTCCATGGTGGTCCTCTGCGTGGGCTCCAAGGGGCAGGTGTTTGCCACGTCGGCCATCAGGGGCATCCGCTTCCTGCAGATCCTGAGGATGCTACACGTCGACCGCCAGGGAGGCACCTGGAGGCTCCTGGGCTCCGTGGTCTTCATCCACCGCCAGGAGCTGATAACCACCCTGTACATCGGCTTCCTGGGCCTCATCTTCTCCTCGTACTTTGTGTACCTGGCTGAGAAGGACGCGGTGA本文档来自技高网...
【技术保护点】
稳定表达人心肌细胞Iks的细胞模型，其特征在于，该细胞模型以CHO‑K1细胞为宿主细胞，包含有KCNQ1基因编码的α亚基单位和KCNE1基因编码的β亚基单位。
【技术特征摘要】
1.稳定表达人心肌细胞Iks的细胞模型，其特征在于，该细胞模型以CHO-K1细胞为宿主
细胞，包含有KCNQ1基因编码的α亚基单位和KCNE1基因编码的β亚基单位。
2.权利要求1所述细胞模型的建立方法，其特征在于，步骤包括：将KCNQ1和KCNE1分
别构建到载体上，然后转染入CHO-K1细胞。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述载体包括pFastBac1-pCDNA3.1(-)和
杆状病毒BacMam。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，将KCNQ1和KCNE1连接到载体上的步骤包
...
【专利技术属性】
技术研发人员：楼庄伟，董海恒，赵娜，梅佳，贾园，陈英，陈侃，孔云华，吴瑶，宋云鹏，吕强，
申请(专利权)人：苏州药明康德新药开发有限公司，上海药明康德新药开发有限公司，无锡药明康德生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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