The invention discloses a construction method based on endoplasmic reticulum stress reporter gene were selected in the method associated with endoplasmic reticulum stress CHOP gene as a specific induction of gene CHOP promoter, the CHOP promoter and SEAP gene for detection of chronic disease virus CHOP connection, construct SEAP plasmid vector; finally CHOP SEAP plasmid was transfected into Hela cells. The invention also discloses the application of the reporter gene cell strain constructed by the construction method of the reporter gene cell strain based on the endoplasmic reticulum stress. Cell reporter gene strains was constructed by the method of the invention can indicate early cell toxicity, greatly improve the detection sensitivity of cell lines and reduces the detection limit, which characterize the early toxicity of toxic substances, and is suitable for most toxic pollutants; and also the comprehensive toxicity characterization of actual water. The reporter gene SEAP gene selected by cell line has the advantages of easy detection and dynamic monitoring.
【技术实现步骤摘要】
一种基于内质网应激的报告基因细胞株构建方法及其应用
本专利技术涉及一种基于内质网应激的报告基因细胞株的构建方法,还涉及上述基于内质网应激的报告基因细胞株构建方法构建的报告基因细胞株的应用,属于污染物毒性细胞检测领域。
技术介绍
据不完全统计,目前世界上已登记的化学物质约400万种,销售、生产、使用的化学物质约有5-6万种,经常使用的约4000多种,而且每年以2万种的速度增加。它们主要包括:化学药物、化学试剂、食品添加剂、农药、装饰材料、建筑材料、化妆品及军工产品等。化学品与人们的饮食、工作、生活及周围环境息息相关,密不可分。同时,化学物对人类健康和生物环境的影响及其危害,也日益受到人们的密切关注。新型的人体细胞毒性试验相较于传统毒性试验而言,可以更直接地体现毒害污染物对于人类健康的影响,但其敏感性仍存在局限性。报告基因法因其敏感、迅速、重现性好的特点,被广泛应用于毒性评价中。研究表明报告基因法可显著降低毒性检出限、提高灵敏度并且缩短响应时间。目前已有的基于报告基因的研究主要是通过特异性的诱导基因和报告基因组合,监测特异性目标物质,例如DNA损伤类物质、内分泌干扰物、二噁英类物质等。但由于污染物毒性效应的复杂性,不同污染物具有不同的毒性效应机制。已有的研究表明内质网应激及损伤是污染物毒性的常见效应之一,因此,构建一株可以指示早期内质网应激及损伤的报告基因细胞株,可以更加灵敏地检测污染物的早期毒性效应。水是生命的第一要素,水质优劣与人体健康密切相关。水污染正在严重地威胁着人类健康。而现有水质安全性评价方法主要为理化指标检测(COD、BOD、氨氮、总氮、总磷等) ...
【技术保护点】
一种基于内质网应激的报告基因细胞株构建方法,其特征在于:该方法选用与内质网应激相关的CHOP基因作为特异性诱导基因构建CHOP启动子,再将CHOP启动子与便于检测的SEAP基因连接,构建慢病毒CHOP‑SEAP质粒载体;最后将CHOP‑SEAP质粒转染至Hela细胞中得到所需的检测细胞株。
【技术特征摘要】
1.一种基于内质网应激的报告基因细胞株构建方法,其特征在于:该方法选用与内质网应激相关的CHOP基因作为特异性诱导基因构建CHOP启动子,再将CHOP启动子与便于检测的SEAP基因连接,构建慢病毒CHOP-SEAP质粒载体;最后将CHOP-SEAP质粒转染至Hela细胞中得到所需的检测细胞株。2.根据权利要求1所述的基于内质网应激的报告基因细胞株构建方法,其特征在于,具体包括如下步骤:步骤1,构建慢病毒CHOP-SEAP质粒载体:将pHBLV-CMVIE-ZsGreen-Puro载体用EcoRI和XhoI酶切,载体酶切完成后进行胶回收;同时根据SEAP基因和CHOP基因序列设计引物并进行PCR扩增,将处理好的目的片段与载体进行连接反应,将连接反应后的片段转化至DH5a感受态细胞中,转化后进行平板挑菌,于37℃下250转/分钟摇菌14小时,用菌液进行PCR鉴定,得到阳性克隆菌液,将阳性克隆菌液进行测序;步骤2,慢病毒CHOP-SEAP质粒载体抽提:从步骤1得到的阳性克隆菌液中抽提慢病毒CHOP-SEAP质粒载体,当慢病毒CHOP-SEAP质粒载体浓度大于1μg/μL,A260/280在1.7~1.8之间时进入下一步的病毒包装;步骤3,慢病毒CHOP-SEAP质粒载体包装:铺板293T细胞用于转染,操作完毕后置于37℃下、5%CO2培养箱中培养...
【专利技术属性】
技术研发人员:吴兵,虞悦,陈慧梅,刘苏,张徐祥,任洪强,
申请(专利权)人:南京大学,
类型:发明
国别省市:江苏,32
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