一种基于多西环素诱导介导型CRISPR基因敲入技术的药物筛选方法技术

本发明专利技术公开一种基于多西环素诱导介导型CRISPR基因敲入技术的药物筛选方法，构建了多西环素诱导介导的CRISPR基因敲入细胞模型，在基因组层面上进行编辑，通过增加多西环素诱导介导的方式，有效避免了长期引入外源基因而导致的可能发生的细胞突变等情况，增加了药物筛选体系的稳定性；还通过引入GFP荧光蛋白检测体系，实现了对基因敲入模型的有效性实现指征，从而克服基因编辑技术潜在的脱靶效应，利于靶点药物的筛选，进一步助力于新药的研发。进一步助力于新药的研发。进一步助力于新药的研发。

【技术实现步骤摘要】
一种基于多西环素诱导介导型CRISPR基因敲入技术的药物筛选方法


[0001]本专利技术涉及生物
，特别是涉及一种基于多西环素诱导介导型CRISPR基因敲入技术的药物筛选方法。

技术介绍

[0002]药物发现计划启动来源于当疾病或临床状况出现时，现有药物没办法满足新的疾病需求，正是这种未满足的临床需求是项目的潜在驱动力。新药研发从无到有，要历经药物发现、临床前研究和临床试验“三部曲”，最后用于疾病治疗。然而在传统的医药研发中，新候选药物的发现和测试通常需要十多年的时间，与药物发现过程相关的总成本可能超过10亿美元。此外，只有少数候选药物能够真正上市，一种新药真正上市的几率只有五千分之一。新药开发的高成本和漫长的努力也使药物开发成为制药公司的一项冒险工作，从而阻碍了新药研发进度。
[0003]随着生物技术的不断发展，近些年CRISPR介导的基因编辑已成为新药研发的强大工具已然成为释放潜在药物靶标的关键，将对现代药物发现和开发产生深远影响。截至目前CRISPR介导的新药研发已经为包括遗传性遗传疾病和病原体感染在内的许多疾病诊疗提供了强有力的支持。通过CRISPR高通量特点系统性敲除大量候选基因不仅能够同时使用HTS检查数百万种化合物加速新药研发，还有助于揭示新的药物靶标和疾病相关性。高通量化合物筛选方法包括生化筛选和基于细胞的筛选。生化筛选主要涉及评估化合物与目标之间的相互作用和结合亲和力，而基于细胞的筛选则利用此类相互作用的功能关系的知识。近年来，CRISPR改进了基于细胞的筛选，通过准确再现疾病的精确基因组编辑从而构建具有疾病特异性遗传背景的细胞系（永生细胞系、原代细胞和干细胞）和类器官实现快速、经济的模型生成，使研究人员能够对化合物进行高通量筛选进而确定最有效的治疗药物分子。该模式可以彻底改变药物设计、节省时间、降低成本并加速药物发现过程。
[0004]然而，CRISPR介导的基因编辑存在潜在的脱靶效应，会对后续的筛选和研究产生无法估量的影响，且基因编辑后的细胞代谢会发生改变等问题也制约着药物研发进度。此外，由于一些疾病是由于基因缺失造成的，而长期过量表达缺失基因会对细胞以及动物生存构成威胁，因此，设计高通量的筛选体系对于药物研发具有重要意义。
[0005]基于药物筛选体系的现状，本领域需要研究一种可诱导基因编辑模型表达特定靶点从而利于药物筛选的方法，不仅能够在靶细胞特异性诱导表达缺失基因，而且能够对模型的有效性进行指征，从而利于靶点药物的研发和筛选。

技术实现思路

[0006]为解决上述技术问题，本专利技术提供的一种基于多西环素诱导介导型CRISPR基因敲入技术的药物筛选方法，包括以下步骤：步骤1、构建pLVX
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EF1a
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IRES
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Puro
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rtTA3质粒，所述pLVX
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EF1a
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IRES
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Puro
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rtTA3
质粒的序列如SEQ ID NO:1所示，将psPAX2质粒、pMD2.G质粒和所述pLVX
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EF1a
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Puro
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rtTA3质粒组成三质粒系统，进行慢病毒包装；步骤2、将步骤1得到的三质粒系统先与jetPRIME转染试剂缓冲液混匀，涡旋振荡后加入jetPRIME转染试剂，混匀后瞬离，静置，所得试剂作为转染试剂备用；步骤3、将293FT细胞进行预处理后加入10cm无抗培养皿中，过夜培养后，向所述无抗培养皿中加入步骤2得到的所述转染试剂，进行转染，转染完成后使用嘌呤霉素筛选293FT细胞，再使用连续梯度稀释法将嘌呤霉素筛选后的细胞铺于96孔板进行培养；步骤4、步骤3所得的细胞形成单克隆扩增后提取基因组DNA进行PCR测序，检测目标基因rtTA3的表达情况，得到目标基因rtTA3稳定表达的单克隆细胞系；所述PCR测序使用MicroGEM的prepGEM Universal基因提取试剂盒完成，每20000个细胞使用10μL 提取试剂来提取基因组DNA，PCR酶采用PrimeSTAR HS DNA Polymerase；步骤5、构建Lenti
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V2
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GAPDH
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sgRNA质粒和BPK1520
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Donor
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GAPDH
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eGFP
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IKZF2质粒，所述Lenti
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V2
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GAPDH
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sgRNA质粒的序列如SEQ ID NO：2所示，所述BPK1520
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Donor
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GAPDH
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eGFP
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IKZF2质粒的序列如SEQ ID NO：3所示；步骤6、使用步骤4得到的稳定表达的rtTA3单克隆细胞系共转Lenti
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V2
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GAPDH
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sgRNA质粒和BPK1520
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Donor
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GAPDH
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eGFP
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IKZF2质粒，共转完成后使用连续梯度稀释法将细胞铺于96孔板并培养，所述连续梯度稀释法是将细胞消化传代并稀释至密度为每10毫升中有50个细胞，之后取100μL在96孔板中铺板；待细胞形成单克隆扩增后使用PCR方法验证并筛选得到稳定表达的IKZF2 单克隆细胞系；所述PCR测序使用MicroGEM的prepGEM Universal基因提取试剂盒完成，每20000个细胞使用10μL 提取试剂来提取基因组DNA，PCR酶采用PrimeSTAR HS DNA Polymerase；步骤7、在步骤6中得到的稳定表达的IKZF2单克隆细胞系中加入多西环素诱导IKZF2表达，使用靶蛋白特异性的抑制剂处理细胞，检测靶蛋白降解趋势、GFP蛋白表达情况和细胞活性，完成药物筛选。
[0007]具体地，步骤2中，所述三质粒系统中，所述pLVX
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EF1a
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IRES
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Puro
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rtTA3质粒的用量为10.65 μg，所述psPAX2质粒的用量为8.598 μg，所述pMD2.G质粒的用量为2.591 μg。
[0008]具体地，步骤2中，所述jetPRIME转染试剂缓冲液的用量为1 mL，所述jetPRIME转染试剂的用量为三质粒系统中的质粒用量总和的2
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3倍。
[0009]具体地，步骤2中，所述静置的条件为室温下静置10
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15 min。
[0010]具体地，步骤3中，所述预处理是指用胰酶消化293FT细胞并重悬，所述293FT细胞的接种量为10
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[0011]具体地，步骤3中，所述转染试剂均匀打入所述无抗培养本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于多西环素诱导介导型CRISPR基因敲入技术的药物筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1、构建pLVX
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rtTA3质粒，所述pLVX
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rtTA3质粒的序列如SEQ ID NO:1所示，将psPAX2质粒、pMD2.G质粒和所述pLVX
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rtTA3质粒组成三质粒系统，进行慢病毒包装；步骤2、将步骤1得到的三质粒系统先与jetPRIME转染试剂缓冲液混匀，涡旋振荡后加入jetPRIME转染试剂，混匀后瞬离，静置，所得试剂作为转染试剂备用；步骤3、将293FT细胞进行预处理后加入10cm无抗培养皿中，过夜培养后，向所述无抗培养皿中加入步骤2得到的所述转染试剂，进行转染，转染完成后使用嘌呤霉素筛选293FT细胞，再使用连续梯度稀释法将嘌呤霉素筛选后的细胞铺于96孔板进行培养；步骤4、步骤3所得的细胞形成单克隆扩增后提取基因组DNA进行PCR测序，检测目标基因rtTA3的表达情况，得到目标基因rtTA3稳定表达的单克隆细胞系；步骤5、构建Lenti
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sgRNA质粒的序列如SEQ ID NO：2所示，所述BPK1520
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IKZF2质粒的序列如SEQ ID NO：3所示；步骤6、使用步骤4得到的稳定表达的rtTA3单克隆细胞系共转Lenti
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sgRNA质粒和BPK1520
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IKZF2质粒，共转完成后使用连续梯度稀释法将细胞铺于96孔板并培养，待细胞形成单克隆扩增后使用PCR方法验证并筛选得到稳定表达的IKZF2 单克隆细胞系；步骤7、在步骤6中得到的稳定表达的IKZF2单克隆细胞系中加入多西环素诱导IKZF2表达，使用靶蛋白特异性的抑制剂处理细胞，检测靶蛋白降解趋势、GFP蛋白表达情况和细胞活性，完成药物筛选。2. 根据权利要求1所述基于多西环素诱导介导型CRISPR基因敲入技术的药物筛选方法，其特征在于，步骤2中，所述三质粒系统中，所述pLVX
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rtTA3质粒的用量为10.65 μg，所述psPAX2质粒的用量为8.598 μg，所述pMD2.G质粒的用量为2.591 μg。3. 根据权利要求1所述的基于多西环素诱导介导型CRISPR基因敲入技术的药物筛选方法，其特征在于，步骤2中，所述jetPRIME转染试剂缓冲液的用量为1 mL，所述jetPRIME转染试剂的用量为三质粒系统中的质粒用量总和的2
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3倍。4. 根据权利要求1所述的基于多西环素诱导介导型CRISPR基因敲入技术的药物筛选方法，其特征在于，步骤2中，所述静置的条件为室温下静置10
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15 min。5.根据权利要求1所述的基于多西环素诱导介导型CRISPR基因敲入技术的药物筛选方法，其特征在于，步骤3中，所述预处理是指用胰酶消化293FT细胞并重悬，所述293FT细胞的...

【专利技术属性】
技术研发人员：王瑞峰，项键，徐能蔚，甘雨苗，谷庆阳，
申请(专利权)人：苏州药明康德新药开发有限公司，
类型：发明
国别省市：