一种提高紫杉醇脂质体冻融稳定性的血浆样品前处理方法技术

本发明专利技术公开一种提高紫杉醇脂质体冻融稳定性的血浆样品前处理方法，全血样品采集后处理为血浆样品，再使用蛋白酶抑制剂处理并冻存，冻融之后对血浆样品进行固相萃取和蛋白沉淀前处理，最后采用超高效液相色谱质谱分析法，检测血浆样品中的脂质体紫杉醇的含量以及游离紫杉醇的含量。本发明专利技术提供的血浆样品前处理方法，提高了紫杉醇脂质体在反复冻融环境下的稳定性，能够保证在反复冻融后，紫杉醇脂质体不会破裂或渗漏，且方法操作简便、试验成本低，无需长时间连续操作，保证操作人员的合理工作时间，从而保证后续实验检测的准确性。从而保证后续实验检测的准确性。从而保证后续实验检测的准确性。

【技术实现步骤摘要】
一种提高紫杉醇脂质体冻融稳定性的血浆样品前处理方法


[0001]本专利技术涉及一种样品处理方法，特别是涉及一种提高紫杉醇脂质体冻融稳定性的血浆样品前处理方法。

技术介绍

[0002]紫杉醇是一种从裸子植物红豆杉的树皮分离提纯的天然次生代谢产物，经临床验证，具有良好的抗肿瘤作用，通过使微管蛋白和组成微管的微管蛋白二聚体失去动态平衡，诱导与促进微管蛋白聚合、微管装配、防止解聚，从而使微管稳定并抑制癌细胞的有丝分裂和触发细胞凋亡，进而有效阻止癌细胞的增殖，特别是对癌症发病率较高的卵巢癌、子宫癌和乳腺癌等有特效。紫杉醇是近年国际市场上最热门的抗癌药物，被认为是人类未来20年间最有效的抗癌药物之一。
[0003]作为一种可用于治疗多种癌症的广谱化疗药物，紫杉醇的水溶性较差，因此，用脂质体作为紫杉醇的递送系统，可以提高药效、降低毒性。脂质体是一种人工膜，在水中磷脂分子亲水头部插入水中，脂质体疏水尾部伸向空气，搅动后，形成双层脂分子的球形脂质体。
[0004]脂质体结构复杂，通常的成分包括阳离子脂质体，卵磷脂，胆固醇和聚乙二醇。尽管脂质体的制备工艺在不断改进，脂质体紫杉醇的稳定性仍然极易受环境因素的影响，比如温度，pH值，氧化剂等，脂质体不稳定，会直接导致药物的渗漏。临床前毒理试验的生物样品中的紫杉醇脂质体药物的定量也面临着巨大挑战，其中，冻融稳定性是一直无法解决的难题。含有紫杉醇脂质体的生物样品在1次冻融循环后，就会导致药物的渗漏，使得游离紫杉醇和脂质体紫杉醇在样品中的相对比例发生改变，从而导致各自定量的不准确性。
[0005]目前，对于紫杉醇脂质体冻融稳定性的常规解决办法是尽量避免反复冻融，在毒理实验中采集动物的全血后，立即离心成血浆，再把得到的血浆立即进行生物分析前处理，即通过固相萃取把游离紫杉醇和脂质体紫杉醇立即分离，之后再分别冻存起来以便后续定量检测。然而，得到血浆后立即进行固相萃取等前处理，这一系列步骤的操作时间较长且操作较为繁琐，长时间的连续工作，不仅增加了操作人员的单次工作强度，还容易导致出现操作失误，影响分析检测的结果；除此之外，避免反复冻融，并不能够从根本上提升紫杉醇脂质体的稳定性，要解决紫杉醇脂质体的冻融稳定性，还应从血浆样品的处理方法上进行创新性改进。
[0006]因此，本领域需要研究一种能够提高紫杉醇脂质体冻融稳定性的血浆样品前处理方法，能够保证在反复冻融后，紫杉醇脂质体不会破裂或渗漏，且方法操作简便、试验成本低，无需长时间连续操作，保证操作人员的合理工作时间，从而保证后续试验检测的准确性。

技术实现思路

[0007]本专利技术所要解决的技术问题在于，提供一种能够提高紫杉醇脂质体冻融稳定性的
血浆样品前处理方法，能够保证在反复冻融后，紫杉醇脂质体不会破裂或渗漏，且方法操作简便、试验成本低，无需长时间连续操作，保证操作人员的合理工作时间，从而保证后续试验检测的准确性。
[0008]为解决上述技术问题，本专利技术提供的一种提高紫杉醇脂质体冻融稳定性的血浆样品前处理方法，包括以下步骤：步骤1、全血样品采集：对毒代实验动物采全血，置于采血管中，所述采血管中添加有抗凝剂；将装有全血样品的采血管轻轻颠倒数次，使全血样品与抗凝剂混匀，放入湿冰中保存；步骤2、血浆样品采集：完成步骤1后1小时内，取步骤1的全血样品，在2800 xg，4 ℃条件下离心10分钟，得到血浆样品；步骤3、蛋白酶抑制剂处理：在经步骤2处理后得到的血浆样品中加入蛋白酶抑制剂，所述蛋白酶抑制剂为SigmaFast蛋白酶抑制剂；步骤4、冻存处理：将步骤3处理后的血浆样品分为两份，分别转移至透明的聚丙烯管中，再将所述聚丙烯管垂直放入干冰，并储存在超低温冰箱中；步骤5、血浆样品的固相萃取和蛋白沉淀前处理：取260
µ
L 的5%葡萄糖溶液置于预冷的离心管中，加入步骤4处理后的血浆40
µ
L，混匀；对HLB固相萃取柱进行润洗、活化和平衡，结束后，从所述离心管中取250
µ
L样品进行上样，之后再用250
ꢀµ
L 10%PBS清洗HLB固相萃取柱；步骤6、采用超高效液相色谱质谱分析检测血浆样品中的脂质体紫杉醇含量以及游离紫杉醇含量：将步骤5中的上样样品和HLB固相萃取柱的洗脱液混匀，取100
µ
L作为检测样品，采用内标法，进行超高效液相色谱质谱联用分析，检测血浆样品中的脂质体紫杉醇的含量；步骤5结束后，对HLB固相萃取柱进行再次洗脱，收集洗脱后的样品，采用内标法，进行超高效液相色谱质谱联用分析，检测血浆样品中的游离紫杉醇的含量；所述内标法采用格列苯脲为内标液，所述格列苯脲的用量为10
µ
L。
[0009]具体地，所述步骤1中，所述抗凝剂为K2 EDTA。
[0010]具体地，所述步骤1中，所述采血管预先在4 ℃条件下预冷处理。
[0011]具体地，所述步骤3中，所述蛋白酶抑制剂为40x SigmaFast蛋白酶抑制剂，且所述蛋白酶抑制剂与血浆样品的体积比为18：1、19：1或20：1中的一种。
[0012]优选地，所述蛋白酶抑制剂与血浆样品的体积比为19：1。
[0013]具体地，所述步骤3中，所述蛋白酶抑制剂预先在4 ℃条件下预冷处理。
[0014]具体地，所述步骤4中，所述聚丙烯管预先在4 ℃条件下预冷处理，所述超低温冰箱的温度设置为
ꢀ‑
60℃。
[0015]具体地，所述步骤5中，对HLB固相萃取柱进行润洗、活化和平衡是指取血浆样品100
µ
L和5% glucose 100
µ
L混匀，再取甲醇200
µ
L和去离子水200
µ
L，对HLB固相萃取柱进行润洗、活化和平衡。
[0016]具体地，所述步骤6中，检测血浆样品中的脂质体紫杉醇的含量时，先在待测样品中加入10
µ
L 格列苯脲和490
µ
L 含0.05% TFA 的乙腈，离心后取100
µ
L上清，再加100
µ
L 去
离子水，混匀进样。
[0017]具体地，所述步骤6中，对HLB固相萃取柱进行再次洗脱是指，先使用5% ACN，20% ACN各200
µ
L清洗HLB板，再使用125
µ
L的90% ACN洗脱HLB固相萃取柱两遍，检测血浆样品中的游离紫杉醇的含量时，收集洗脱液后混匀取100
µ
L，加入10
µ
L 格列苯脲，再加100
µ
L 去离子水，混匀进样。
[0018]本专利技术的样品前处理方法具有以下有益效果：1、本专利技术方法在处理血浆时，通过添加适量的SigmaFast蛋白酶抑制剂，有效抑制血浆中质蛋白酶对脂质体胆固醇的分解，胆固醇能够通过降低脂质体的流动性来减少脂质体的渗漏，因此，防止胆固醇的分解，能够有效提升紫杉醇脂质体的稳定性，防止其发生破裂和渗本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种提高紫杉醇脂质体冻融稳定性的血浆样品前处理方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1、全血样品采集：对毒代实验动物采全血，置于采血管中，所述采血管中添加有抗凝剂；将装有全血样品的采血管轻轻颠倒数次，使全血样品与抗凝剂混匀，放入湿冰中保存；步骤2、血浆样品采集：完成步骤1后1小时内，取步骤1的全血样品，在2800 xg，4 ℃条件下离心10分钟，得到血浆样品；步骤3、蛋白酶抑制剂处理：在经步骤2处理后得到的血浆样品中加入蛋白酶抑制剂，所述蛋白酶抑制剂为SigmaFast蛋白酶抑制剂；步骤4、冻存处理：将步骤3处理后的血浆样品分为两份，分别转移至透明的聚丙烯管中，再将所述聚丙烯管垂直放入干冰，并储存在超低温冰箱中；步骤5、血浆样品的固相萃取和蛋白沉淀前处理：取260
µ
L 的5%葡萄糖溶液置于预冷的离心管中，加入步骤4处理后的血浆40
µ
L，混匀；对HLB固相萃取柱进行润洗、活化和平衡，结束后，从所述离心管中取250
µ
L样品进行上样，之后再用250
ꢀµ
L 10%PBS清洗HLB固相萃取柱；步骤6、采用超高效液相色谱质谱分析检测血浆样品中的脂质体紫杉醇含量以及游离紫杉醇含量：将步骤5中的上样样品和HLB固相萃取柱的洗脱液混匀，取100
µ
L作为检测样品，采用内标法，进行超高效液相色谱质谱联用分析，检测血浆样品中的脂质体紫杉醇的含量；步骤5结束后，对HLB固相萃取柱进行再次洗脱，收集洗脱后的样品，采用内标法，进行超高效液相色谱质谱联用分析，检测血浆样品中的游离紫杉醇的含量；所述内标法采用格列苯脲为内标液，所述格列苯脲的用量为10
µ
L。2.根据权利要求1所述提高紫杉醇脂质体冻融稳定性的血浆样品前处理方法，其特征在于，所述步骤1中，所述抗凝剂为K2 EDTA。3.根据权利要求1所述的提高紫杉醇脂质体冻融稳定性的血浆样品前处理方法，其特征在于，所述步骤1中，所述采血管预先在4 ℃条件下预冷处理。4.根据权利要求1所述的提高紫杉醇脂质体冻融稳定性的血浆样品前处理方法，其特征在于，所述步骤3中，所述蛋白酶抑制剂为40x Sig...

【专利技术属性】
技术研发人员：蒋丽英，王逸帆，金晓莺，施婧，
申请(专利权)人：苏州药明康德新药开发有限公司，
类型：发明
国别省市：