一种用于筛选肽类和非肽类GLP‑1类似物的细胞株及其制备方法与应用技术

一种用于筛选肽类和非肽类GLP‑1类似物的细胞株及其应用，属于药物高通量筛选检测技术领域。本发明专利技术涉及一种稳定表达荧光标记人胰高血糖素样肽‑1受体(GLP‑1R)蛋白细胞株GLP‑1R/U2OS的建立，以及基于GLP‑1R/U2OS细胞株受到GLP‑1类似物Exendin‑4刺激后细胞内形成荧光斑点，用高内涵系统观察分析形态变化来测定GLP‑1类似物生物活性的检测方法。该检测方法易标准化，重复性好，具有GLP‑1受体特异性、成本低、准确和方便的特点，具有良好的应用前景。

A method for screening peptide and non peptide analogues of GLP 1 cell line and preparation method and application thereof

A method for screening peptide and non peptide GLP analogues of 1 cell lines and its application, which belongs to the technical field of high-throughput screening drug detection. The invention relates to a stable expression of fluorescent labeled human glucagon like peptide 1 receptor (GLP 1R) to establish GLP cell line protein 1R/U2OS, and GLP based 1R/U2OS cell line by GLP 1 analogue Exendin fluorescent spots formed 4 stimulated cells, with high content of observation and analysis system the morphological changes of GLP to determine 1 analogue biological activity detection method. This method can be easily standardized and reproducible, with GLP 1 receptor specificity, low cost, accurate and convenient, and has good application prospect.

【技术实现步骤摘要】
一种用于筛选肽类和非肽类GLP-1类似物的细胞株及其制备方法与应用本申请是2014年5月29日提交的、题为“一种用于筛选肽类和非肽类GLP-1类似物的细胞株及其制备方法与应用”的中国申请201410234121.2的分案申请。
本专利技术属于药物高通量筛选检测
，具体地，涉及一种表达荧光标记人胰高血糖素样肽-1受体(GLP-1R)蛋白细胞株GLP-1R/U2OS细胞株及其建立方法，以及基于此细胞株受到胰高血糖素样肽-1类似物刺激后细胞内产生荧光斑点的形态变化来测定胰高血糖素样肽-1类似物生物活性及其受体激动剂、拮抗剂和调节剂的检测方法。
技术介绍
肠促胰岛素是在养分吸收以增加胰岛素分泌时胃肠道释放的激素。占肠促胰岛素大多数效应的两种肠道肽是：1)GLP-1(Glucagon-likepeptide,胰高血糖素样肽1)：是由胰高血糖素原基因编码、在营养物质刺激下由小肠L细胞(Langerhanscell)分泌的含30或31个氨基酸的激素，GLP-1通过作用于胰腺β细胞而发挥促进胰岛素的分泌和抑制胰高血糖素分泌的作用，GLP-1及其受体广泛分布于中枢神经系统、胰腺和胃肠道系统。2)GIP(Gastricinhibitionpolypeptideorglucose-dependentinsulinotropicpeptide，葡萄糖依赖性促胰岛素多肽)：被十二指肠和近端空肠K细胞分泌。从小肠部位释放的几分钟内，GLP-1和GIP被二肽基肽酶-IV(DPP-IV)进行迅速代谢(蛋白水解裂解)成无活性代谢物。小量活性激素到达胰腺作用于在beta-细胞上的受体位点以葡萄糖依赖方式刺激胰岛素分泌；而且GLP-1作用在alpha细胞和抑制胰高血糖素的分泌。目前基于肠促胰岛素的治疗主要分为两大类即DPP-IV抑制剂(如西格列汀、利拉利汀等)和GLP-1受体激动剂(基于Exendin-4治疗，如艾塞那肽；人GLP-1类似物，如利拉鲁肽)。GLP-1目前被认为是最重要的肠促胰岛素，其发挥着大约70-80％的肠促胰岛素活性，所有这些生理特征均显示GLP-1将在2型糖尿病的治疗中发挥重要作用。新型降糖药物GLP-1受体激动剂可显著、持久降低糖化血红蛋白水平，并具有迅速、高效降低血糖，改善胰岛β细胞功能，降低体重等功效。无论是动物水平还是细胞水平，GLP-1受体激动剂均表现出抗高血糖的生理作用；促进胰岛素的释放，抑制胰高血糖素的分泌，延迟胃排空，促进β细胞的增殖和再生，抑制β细胞的凋亡。GLP-1及其类似物的相关研究虽然已经取得了不错的进展，多种类似物也进入了临床试验阶段，然而由于多肽类药物具有一个共同的弊端，即不能口服给药，只能通过皮下注射，因此对于长期用药的二型糖尿病(T2DM)患者来说其依从性仍旧不高。由于多肽类药物的特性，其稳定性依赖于时间、温度及pH值，保藏条件要求较高。另外，由于这些激动剂都给人体引入了外源蛋白，可能会引发机体的免疫反应。目前上市的GLP-1类似物价格昂贵，会加重患者的经济负担。目前筛选小分子GLP-1类似物已成为研究热点。建立有效的GLP-1类似物生物活性的测定方法，是评价新药药效的关键措施之一。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种新的体外筛选胰高血糖素样肽-1受体的肽类和非肽类激动剂、调节剂和拮抗剂的方法，提供一种表达荧光标记人胰高血糖素样肽-1受体(GLP-1R)蛋白细胞株GLP-1R/U2OS细胞株及其建立方法，XFP直接标记GLP-1R的C末端，以及基于此细胞株受到胰高血糖素样肽-1类似物刺激后细胞内产生荧光斑点的形态变化来测定胰高血糖素样肽-1类似物生物活性的检测方法。本专利技术以下述的技术方案来得以实现本专利技术的上述目的的：一株GLP-1R/U2OS细胞株，由下述方法获得：构建人胰高血糖素样肽-1受体(GLP-1R)荧光蛋白(XFP)真核表达载体GLP-1R/pCMV6，并稳定转染人骨肉瘤U2OS细胞，获得一株GLP-1R/U2OS细胞株。所述的GLP-1R/U2OS细胞株含有的荧光蛋白(XFP)，是GFP(greenfluorescenceprotein)、YFP(yelowfluorescenceprotein)、RFP(redfluorescenceprotein)或任何具有荧光性质的蛋白。所述的GLP-1R/U2OS细胞株或其它适用的细胞如HEK293(humanembroynickidney293)细胞，由下述方法获得：先构建人胰高血糖素样肽-1受体(GLP-1R)绿色荧光蛋白(GFP)真核表达载体GLP-1R/pCMV6，再按Lipofectamine2000操作说明书进行转染U2OS细胞。G418(400μg/ml)加压筛选2周，获得具有抗生素抗性的阳性细胞克隆，扩增培养即为稳定表达人GLP-1R的U2OS细胞系，命名为GLP-1R/U2OS细胞株。用所述的GLP-1R/U2OS细胞株测定GLP-1类似物生物活性的方法，转染了XFP标记的GLP-1R基因的条件下，在受体激动剂刺激下诱导GLP-1R/U2OS细胞内产生荧光斑点，转染的GLP-1R能稳定表达。如所述的方法，其中所述的受体激动剂为GLP-1类似物，GLP-1受体与配体结合后细胞内产生荧光斑点强度与受体激动剂的活性呈正相关，用高内涵系统观察分析测定GLP-1R/U2OS细胞内荧光斑点强度，测定受体激动剂的生物活性。如所述的方法，其中所述的GLP-1类似物为促胰岛素分泌肽Exendin-4。如所述的方法，用高内涵系统观察GLP-1R的表达情况结果，用GLP-1R/U2OS细胞内荧光斑点平均强度变化测定GLP-1类似物和GLP-1R生物活性物包括GLP-1受体激动剂、拮抗剂和调节剂等。本专利技术提供了稳定表达荧光标记人胰高血糖素样肽-1受体(GLP-1R)蛋白细胞株GLP-1R/U2OS的建立，以及基于GLP-1R/U2OS细胞株受到GLP-1类似物Exendin-4刺激后细胞内形成荧光斑点，用高内涵系统观察分析形态变化来测定GLP-1类似物生物活性的检测方法。该检测方法易标准化，重复性好，具有GLP-1受体特异性、成本低、准确和方便的特点，具有良好的应用前景。目前国内筛选GLP-1受体激动剂的方法是将GLP-1受体的基因和报告基因共转染到细胞内，并将GLP-1受体表达在细胞表面，通过刺激后细胞内cAMP水平变化对激动剂进行筛选。本专利技术提供了荧光标记人胰高血糖素样肽-1受体(GLP-1R)蛋白细胞株GLP-1R/U2OS，相比国内的筛选方法具有快速、灵敏、专一性高等优点，而且会大大降低假阳性的发生，并且可以针对混合物进行筛选，同时也会降低检测成本。更具体地，本申请涉及：1、一株GLP-1R/U2OS细胞株，其特征在于由下述方法获得：构建人胰高血糖素样肽-1受体荧光蛋白真核表达载体GLP-1R/pCMV6，并稳定转染人骨肉瘤U2OS细胞，获得一株GLP-1R/U2OS细胞株。2、根据项1所述的GLP-1R/U2OS细胞株含有的荧光蛋白XFP是GFP、YFP、RFP或任何具有荧光性质的蛋白。3、根据项1所述的GLP-1R/U2OS细胞株或其它适用的细胞如HEK293细胞，其特征在于由下述方法获得：先构建人胰高血糖素样肽本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种表达人胰高血糖素样肽‑1受体(GLP‑1R)的U2OS细胞株，所述GLP‑1R的C末端带有荧光标记。

【技术特征摘要】
1.一种表达人胰高血糖素样肽-1受体(GLP-1R)的U2OS细胞株，所述GLP-1R的C末端带有荧光标记。2.权利要求1的细胞株，其中的荧光标记是具有荧光性质的蛋白。3.权利要求2的细胞株，其中的具有荧光性质的蛋白是绿色荧光蛋白(GFP)。4.权利要求1～3任一项的细胞株的制备方法，包括以下步骤：(1)构建人GLP-1R-荧光蛋白的真核表达载体，...

【专利技术属性】
技术研发人员：姚洪玉，魏云林，张敏，张宽仁，刘东波，季秀玲，
申请(专利权)人：昆明贝尔吉科技有限公司，昆明理工大学，
类型：发明
国别省市：云南,53