包含VEGF及PDGF的配体结合域的融合蛋白制造技术

本发明专利技术关于融合蛋白，其含有PDGF结合部分(binding portion)、VEGF结合部分、及Fc抗体区。本发明专利技术也关于编码该融合蛋白的核酸、包含该融合蛋白的组合物、及使用该融合蛋白以治疗或预防临床症状的方法，该临床症状的特征在于异常的血管生成，例如血管渗透性、水肿、或发炎。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】包含VEGF及PDGF的配体结合域的融合蛋白本申请依美国专利法35U.S.C.§119(e)主张于2015年3月11日提出申请的美国临时专利申请第62/131,261号的优先权权益，该美国临时专利申请的全文并于此处以供参考。本申请包括通过EFS-Web电子送件的序列表，该序列表为ASCII格式，文件名为“688947-3WO_ST25”，建文件日期为2016年3月3日，文件大小为88.9千字节。该通过EFS-Web电子送件的序列表是本说明书的一部分，且全文并于此处以供参考。
本专利技术关于融合蛋白(其包含PDGF结合部分(bindingportion)、VEGF结合部分、及Fc抗体区)、编码该融合蛋白的核酸及表现载体(expressionvector)、其重组细胞、及包含该融合蛋白的组合物。也提供使用该融合蛋白以抑制PDGF及VEGF功能的方法。
技术介绍
血管生成(自既存血管形成新血管)在胎儿发育及组织修复中是正常且重要的程序。血管生成受血管生成及抗血管生成两种因子高度调控，且其参与内皮细胞的迁移及增生、血管成熟及重塑、及胞外基质的分解。不仅其在正常生长及发育中是一重要的程序，血管生成也在肿瘤生长、局部缺血、及发炎中扮演关键的角色。在快速的未受控眼部血管生成过程中，血管渗透性增加，导致血管脆弱及漏泄，因而造成出血及液体与蛋白质渗出物的累积，最终造成血管功能不全或血管过度生长。眼部血管生成可发生在一系列的眼部病症中，例如老年性黄斑退化(age-relatedmaculardegeneration，AMD)、增生性糖尿病神经病变(proliferativediabeticneuropathy，PDR)、及角膜血管新生(cornealneovascularization)。AMD及PDR两者皆可造成视网膜神经结构及功能的损伤，最终造成视力丧失。如果不处理，该不正常的血管可导致纤维性结疤，对视网膜功能造成不可逆损伤，其最后可造成失明(Zhang及Ma，ProgRetinEyeRes.2007Jan；26(1):1-37)。角膜血管新生可类似地导致角膜透明度降低及视力丧失。血管内皮生长因子(vascularendothelialgrowthfactor，VEGF)在血管生成中扮演一个重要的角色。人类VEGF家族含有6种成员：VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E、及胎盘生长因子(placentalgrowthfactor，PlGF)。另外，VEGF-A、VEGF-B、及PlGF的多种同功体通过选择性RNA剪接来产生(Sullivan及Brekken，MAbs.2010Mar-Apr；2(2):165-75)。VEGF-A是该家族中的原型成员且定性最为清楚。已显示VEGF-A作为内皮细胞的细胞分裂因子，可以促进内皮细胞生存及增生，诱导细胞迁移及增加微血管渗透性。VEGF家族的蛋白是通过结合至细胞表面VEGF受体(VEGFR)的胞外区来活化VEGF讯息路径。有三种型态的VEGFR蛋白：VEGFR1、VEGFR2、及VEGFR3，且其各含有包含七个类免疫球蛋白(Ig)结构域的胞外区。该VEGFR的胞外区结合至不同的VEGF蛋白。举例而言，VEGFR-1(Flt-1)结合至VEGF-A、VEGF-B、及PlGF，且可作为用于VEGF的诱饵受体(decoyreceptor)，或作为VEGFR-2的调节子。VEGFR-2(KDR/Flt-1)与所有VEGF同功体结合，且是VEGF诱导的血管生成讯息的主要介质。VEGFR-3(Flt-4)与VEGF-C及VEGF-D结合，但不与VEGF-A结合，且是作为淋巴管生成(lymphangiogenesis)的介质。高分子量变异体VEGF206及VEGF189K紧密地结合至胞外膜，且不与VEGF受体交互作用。而VEGF165是主要的可溶性变异体，VEGF121及VEGF145也是结合至VEGFR1及VEGFR2受体的可溶性变异体，和分解产物VEGF110一样(Bhisitkuk，BrJOphthalmol.2006Dec；90(12):1542-7)。以抗体、可溶性VEGF受体、或VEGF酪胺酸激酶活性的抑制剂来阻断VEGF活性，是已被用于治疗血管生成型病症(angiogenic-typedisorder)(例如AMD)的策略。虽然抗VEGF疗法一般可稳定或改善视觉功能，其已被报告在抗VEGF治疗两年内，在所有经治疗的眼睛中大约半数产生次视网膜结疤或纤维化(Daniel等人，Ophthalmology.2014Mar；121(3):656-66)。另外，仅靶向VEGF虽可避免新生血管的形成，但其对已建立的血管没有效果。最近的数据暗示周细胞(pericyte)可在抗VEGF抗性、新血管的稳定、及结疤中扮演一角色。周细胞与内皮细胞交互作用，并帮助血液-视网膜屏障的建立。重要的是，周细胞提供存活讯息至新生血管内皮细胞，使其抵抗VEGF耗竭疗法(Benjamin等人，Development.1998May；125(9):1591-8；Patel，Retina.2009Jun；29(6Suppl):S45-8)。血小板衍生生长因子(platelet-derivedgrowthfactor，PDGF)控制周细胞，驱使其补充、增生、存活及调控新血管的成熟。人类PDGF家族含有四种成员：PDGF-A、PDGF-B、PDGF-C、及PDGF-D。该四种PDGF蛋白形成同二聚体或异二聚体(例如，PDGF-AA、PDGF-AB、PDGF-BB、PDGF-CC、及PDGF-DD)，且其在单体型时是无活性的。该二聚蛋白结合至细胞表面PDGF受体(PDGFR)的胞外区，以活化PDGF讯息路径。有两种型态的PDGF受体，PDGFR-α及PDGFR-β，其形成同二聚体或异二聚体(例如，PDGFR-αα、PDGFR-ββ、及PDGFR-αβ)且含有包含五个类免疫球蛋白结构域的胞外区。该受体的配体结合位位在前三个类免疫球蛋白结构域(D1至D3)。该PDGFR二聚体的胞外区结合至不同的PDGF蛋白。举例而言，PDGFR-αα专一性地与PDGF-AA、PDGF-AB、PDGF-BB、及PDGF-CC交互作用。PDGFR-αβ专一性地与PDGF-AB、PDGF-BB、PDGF-CC、及PDGF-DD交互作用。PDGFR-ββ专一性地与PDGF-BB及PDGF-DD交互作用。PDGF-BB是唯一可以高亲合力结合至所有三种受体二聚体型的PDGF，其在体外及体内两者皆已被显示可以诱导周细胞增生及迁移。先前已显示由PDGFR-β的所有五个类免疫球蛋白结构域(D1至D5)组成的胞外区，拮抗通过PDGF-B所刺激的反应(Duan等人，JBiolChem.1991Jan5；266(1):413-8；Ueno等人，Science.1991May10；252(5007):844-8)。使用PDGFRβ-Fc嵌合蛋白(chimericprotein)的研究，证明人类PDGFR-β的D1至D3对高亲合力PDGF-BB配体结合是足够的(Heidaran等人，FASEBJ.1995Jan；9(1):140本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种融合蛋白，其特征在于，其包含：a.一第一胜肽，其包含一VEGF受体的胞外配体结合域(binding domain)，b.一抗体的Fc区(Fc region)，以及c.一第二胜肽，其包含一PDGF受体的胞外配体结合域；其中，该融合蛋白从N端至C端是依照选自由以下所组成的群组的次序排列：(a)‑(b)‑(c)及(c)‑(b)‑(a)；以及其中，该融合蛋白可以结合至一VEGF及一PDGF以及抑制该VEGF的活性及该PDGF的活性。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.03.11 US 62/131,2611.一种融合蛋白，其特征在于，其包含：a.一第一胜肽，其包含一VEGF受体的胞外配体结合域(bindingdomain)，b.一抗体的Fc区(Fcregion)，以及c.一第二胜肽，其包含一PDGF受体的胞外配体结合域；其中，该融合蛋白从N端至C端是依照选自由以下所组成的群组的次序排列：(a)-(b)-(c)及(c)-(b)-(a)；以及其中，该融合蛋白可以结合至一VEGF及一PDGF以及抑制该VEGF的活性及该PDGF的活性。2.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于：a.该VEGF受体的胞外配体结合域包含一VEGFR1的类免疫球蛋白结构域D2(Ig-likedomainD2)、及一VEGFR2的类免疫球蛋白结构域D3；b.该抗体的Fc区包含IgG1的一CH2及一CH3区；以及c.该PDGF受体的胞外配体结合域包含PDGFRβ的类免疫球蛋白结构域D1至D3。3.如权利要求2所述的融合蛋白，其特征在于：a.该VEGF受体的胞外配体结合域包含一与SEQIDNO:7具有至少90％同一性的一胺基酸序列；b.该抗体的Fc区包含一与SEQIDNO:12具有至少90％同一性的胺基酸序列；以及c.该PDGF受体的胞外配体结合域包含一与SEQIDNO:2具有至少90％同一性的胺基酸序列。4.如权利要求3所述的融合蛋白，其特征在于：a.该VEGF受体的胞外配体结合域包含选自由以下所组成的群组的胺基酸序列：SEQIDNO:7及SEQIDNO:10；b.该抗体的Fc区包含选自由以下所组成的群组的胺基酸序列：SEQIDNO:12及SEQIDNO:15；以及c.该PDGF受体的胞外配体结合域包含选自由以下所组成的群组的胺基酸序列：SEQIDNO:2及SEQIDNO:5。5.如权利要求1至4中的任一项所述的融合蛋白，其特征在于，其还包含一第一连接胜肽(linkerpeptide)，其位于该融合蛋白的C端处的第一或第二胜肽与该Fc区之间，以及根据需要包含一第二连接胜肽，其位于该融合蛋白的N端处的第二或第一胜肽与该Fc区之间。6.如权利要求5所述的融合蛋白，其特征在于，该第一连接胜肽包含一或多个选自由以下所组成的群组的胺基酸序列：SEQIDNO:20、SEQIDNO:22、SEQIDNO:24、SEQIDNO:26、SEQIDNO:28、S...

【专利技术属性】
技术研发人员：曾国辉，吴佩姿，何正宏，陈皇慈，柳钧翔，徐静轩，
申请(专利权)人：新源生物科技股份有限公司，圆祥生命科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：中国台湾,71