通过融合到来自七鳃鳗的序列进行的重组蛋白多聚化制造技术

本发明专利技术涉及聚合重组蛋白、编码这些聚合重组蛋白的重组核酸、包含这些重组核酸的表达盒、通过这些表达盒转化的宿主细胞以及用于使重组蛋白多聚化的方法。本发明专利技术的聚合蛋白质可以用于药物或免疫原性组合物中。具体地，这些重组蛋白可以是抗原、抗体或支架。具体地，该聚合重组蛋白可以是流感血球凝集素。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】通过融合到来自七鳃鳗的序列进行的重组蛋白多聚化
本专利技术总体上涉及多聚体重组蛋白的产生。专利技术背景蛋白质负责大多数细胞功能，诸如分子识别(例如在免疫系统中)、信号传导途径(激素)、代谢物和营养物质的运输以及生化反应的催化(酶)。蛋白质的功能由它们的三维结构引起，亦即多肽链的氨基酸如何在空间上相对于彼此安排。蛋白质通常仅处于蛋白质可以发挥其生物活性的折叠状态(天然状态)下。虽然大多数蛋白质具有一级结构(氨基酸序列)、二级结构(α-螺旋和β-折叠)和三级结构(三维)，但蛋白质低聚物具有被称为四级结构的另外的水平，该四级结构是三维结构的一部分。低聚物是若干多肽的复合物。它们可以包含被称为亚基的相同蛋白质的若干拷贝，并且被称为同源低聚物，或者它们可以由超过一种类型的蛋白质亚基组成，在这种情况下，它们被称为异源低聚物。血红蛋白是血液中的氧载体，它是包含相同亚基的蛋白质的实例。固氮酶是负责将氮气还原成氨的微生物酶，它是包含不相同的亚基的蛋白质的实例。感兴趣的许多重组蛋白实质上是低聚物，例如抗体、许多跨膜蛋白诸如跨膜受体、孔蛋白、病毒表面抗原，热休克蛋白、病毒衣壳蛋白、铁蛋白、胰岛素、许多酶诸如谷胱甘肽过氧化物酶、过氧化氢酶或超氧化物歧化酶、胶原蛋白等等。例如，流感病毒血球凝集素(HA)是病毒表面上的同源三聚体糖蛋白，其负责病毒与宿主细胞受体的相互作用。HA的三维结构在自然(Nature)，289，366-373(1981)中有详细描述。通过针对流感病毒的疫苗接种诱导的保护性免疫应答主要针对病毒HA蛋白质。重组HA蛋白质(rHA)因此代表了用于开发流感疫苗的感兴趣抗原。另一种感兴趣的低聚物抗原是发现在细菌的针尖处形成五聚体或在IpaB存在下形成四聚体的志贺氏菌(Shigella)侵袭质粒抗原D(IpaD)蛋白质(张(Cheung)等人，分子微生物学(MolecularMicrobiology)，95(1)，31-50(2015))。另外感兴趣的低聚物抗原是志贺氏菌的IpaH(MxiH)蛋白质的膜表达，已发现该蛋白质形成产生志贺氏菌针的亚基的螺旋组件(科德斯(Cordes)等人，生物化学期刊(TheJournalofBiologicalChemistry)，278(19)，17103-17107(2003))。重组蛋白领域的挑战之一是重组蛋白并不总是具有与天然蛋白相同的三维构象。然而，蛋白质的功能通常由它们的三维结构引起。类似地，相对于低聚物，如果重组蛋白不保留天然蛋白的四级结构，则重组蛋白的功能可能被改变或受到抑制。例如，威廉·C.·威尔顿(WilliamC.Weldon)等人在PlosOne，5(9)，e12466(2010)中表明，重组流感血球凝集素的差的三聚作用可能在其低免疫原性中起作用。因此，需要产生更好地保留低聚物结构和天然蛋白所希望的生物学功能的重组蛋白。志仁·魏(Chih-JenWei)等人，在病毒学期刊(JournalofVirology)，82(13)，6200-6208(2008)中描述了使用T4噬菌体的折叠序列进行的流感rHA的三聚化。专利技术概述本专利技术人令人惊讶地确定七鳃鳗可变淋巴细胞受体B(VLR-B)抗体的序列的片段可以用于使异源融合蛋白多聚化。七鳃鳗是无颌脊椎动物，它具有由克隆上多样的淋巴细胞组成的适应性免疫系统，这些淋巴细胞表达由富含亮氨酸重复基因片段的组合组件产生的可变淋巴细胞受体(VLR)。VLR-B可以被分泌并且可以类似于颌类脊椎动物中的抗体起作用。令人惊讶的是，发现编码感兴趣蛋白质的核酸序列和编码存在于七鳃鳗VLR-B抗体最后C-末端(即C-末端到茎部区域(Stalk)(在WO2008/016,854的图11C中称为“C-TERM”的结构域))的肽的核酸序列的融合物编码能够以若干低聚程度进行低聚化的重组蛋白。更令人惊讶的是，发现所获得的多聚体重组蛋白是稳定的。以及甚至更令人惊讶的是，我们发现获得的稳定的多聚体重组蛋白具有若干低聚程度，同时保持它们天然形式的生物活性。根据一个实施例，获得一种分子，该分子包含与SEQIDNO：1具有至少80％一致性的第一氨基酸序列和与所述第一序列异源的第二氨基酸序列。根据另一个实施例，获得一种重组蛋白，该重组蛋白包含与SEQIDNO：1具有至少80％一致性的第一氨基酸序列和与所述第一序列异源的第二氨基酸序列。根据另一个实施例，构建一种重组核酸，该重组核酸包含与SEQIDNO：3具有至少80％一致性的第一核酸序列和与所述第一序列异源的第二核酸序列。另一个方面涉及一种包含如上所述的重组核酸的表达盒，其中该重组核酸可操作地连接到启动子。另一个方面涉及一种使用表达盒转化的宿主细胞。本专利技术还涉及一种稳定的同源多聚体重组蛋白，该同源多聚体重组蛋白包含选自下组的蛋白质，该组由流感HA蛋白质、志贺氏菌IpaD蛋白质和志贺氏菌MxiH蛋白质的胞外域组成，该蛋白质融合到含有与SEQIDNO：1具有至少80％一致性的氨基酸序列的蛋白质。另一个实施例涉及一种药物组合物，该药物组合物包含本专利技术的分子或重组蛋白和药学上可接受的载体或稀释剂。在另一个方面，本专利技术提供一种免疫原性组合物，该免疫原性组合物包含本专利技术的分子或重组蛋白。在另一个实施例中，本专利技术的分子或重组蛋白是用作药物。在本专利技术的另一方面中，本专利技术的分子或重组蛋白是用于诱导对于受试者中的抗原的免疫应答。本专利技术还涉及一种用于使重组蛋白多聚化的方法，该方法包括：a)将与SEQIDNO：3具有至少80％一致性的核酸序列融合到编码所述重组蛋白的核酸序列，其条件是所述重组蛋白不是七鳃鳗VLR-B抗体蛋白质，b)在引起所述重组蛋白多聚化的条件下，表达由所述核酸序列编码的融合蛋白。定义在本专利技术的上下文中，蛋白质“低聚物”或“聚合物”或“多聚体”具有相同的含义，即，蛋白质具有四级结构，是至少两个多肽的复合物，所述多肽可以是相同或不同的。因此，在本专利技术的上下文中，“多聚化”、“低聚化”和“聚合”具有相同的含义，“多聚化的”、“低聚化的”和“聚合的”或“使...多聚化”、“使...低聚化”和“聚合...”也一样。“重组蛋白”是由重组核酸编码的蛋白质。它们由宿主细胞中的重组核酸表达。在此使用“重组核酸”描述核酸分子，根据其来源或操作，该核酸分子不与其天然缔合的多核苷酸全部或部分缔合和/或连接到除了与其天然连接的多核苷酸之外的多核苷酸。本专利技术的重组蛋白包含来自七鳃鳗的VLR-B抗体的蛋白质片段和与来自七鳃鳗的VLR-B抗体的蛋白质片段异源的感兴趣蛋白质。如在此所述的，本专利技术的重组蛋白包含来自七鳃鳗的VLR-B抗体的最后C-末端的蛋白质片段。在本专利技术的上下文中，“分子”是在来自七鳃鳗的VLR-B抗体的蛋白质片段和与来自七鳃鳗的VLR-B抗体的蛋白质片段异源的感兴趣蛋白质之间以任何方式的接合。例如，本专利技术的分子可以经由共价键通过接合VLR-B蛋白质和感兴趣的异源蛋白来产生。这样的共价键的实例包括肽键、酯键、酰胺键以及二硫键。如在此所述的，来自七鳃鳗的VLR-B抗体的蛋白质片段来自于七鳃鳗的VLR-B抗体的最后C-末端。在本专利技术的分子或重组蛋白的说明中的“第一氨基酸序列”和“第二氨基酸序列”，并非意指考虑序列的特定顺序。这仅是为了使本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种分子，包含与SEQ ID NO：1具有至少80％一致性的第一氨基酸序列和与所述第一序列异源的第二氨基酸序列。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.12.19 EP 14307096.91.一种分子，包含与SEQIDNO：1具有至少80％一致性的第一氨基酸序列和与所述第一序列异源的第二氨基酸序列。2.根据权利要求1所述的分子，其中所述分子是重组蛋白。3.根据权利要求1或2所述的分子，该分子包含对应于SEQIDNO：1的位置2、7、13、19、21、24以及27的该分子内的位置处的半胱氨酸残基。4.根据权利要求1至3中任一项所述的分子，其中该第一氨基酸序列与SEQIDNO：1具有至少90％一致性或100％一致性。5.根据权利要求1至3中任一项所述的分子，该分子包含SEQIDNO：2。6.根据权利要求1至5中任一项所述的分子，其中所述分子不是七鳃鳗VLR-B抗体蛋白。7.根据权利要求1至6中任一项所述的分子，其中所述分子不包含来自七鳃鳗VLR-B抗体的富含亮氨酸重复(LRR)模块。8.根据权利要求1至7中任一项所述的分子，其中所述分子不包含选自由SEQIDNO：29限定的序列的组的序列。9.根据权利要求1至8中任一项所述的分子，其中所述分子中源自于源自于七鳃鳗VLR-B抗体的唯一氨基酸序列是与SEQIDNO：1具有至少80％、至少90％或100％一致性的序列。10.根据权利要求1至9中任一项所述的分子，其中在该第一氨基酸序列与该异源氨基酸序列之间存在接头。11.根据权利要求1至10中任一项所述的分子，其中该异源氨基酸序列编码抗原。12.根据权利要求11所述的分子，其中该抗原是选自下组，该组由以下各项组成：流感病毒、HIV、巨细胞病毒、登革病毒、黄热病病毒、蜱传脑炎病毒、肝炎病毒、日本脑炎病毒、人乳头状病毒、柯萨奇病毒、单纯疱疹病毒、风疹病毒、腮腺炎病毒、麻疹病毒、狂犬病病毒、脊髓灰质炎病毒、轮状病毒、呼吸道合胞体病毒、埃博拉病毒、基孔肯雅病毒、结核分枝杆菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、大肠杆菌、艰难梭菌、百日咳杆菌、破伤风梭菌、b型流感嗜血杆菌、肺炎衣原体、沙眼衣原体、牙龈卟啉单胞菌、铜绿假单胞菌、白喉杆菌、志贺氏菌、脑膜炎奈瑟菌、肺炎链球菌以及恶性疟原虫。13.根据权利要求12所述的分子，其中该抗原是来自流感病毒，并且是选自下组，该组由以下各项组成：血球凝集素(HA)、基质2蛋白质(M2)和HAM2融合蛋白。14.根据权利要求13所述的分子，其中该抗原是流感血球凝集素，优选地是流感血球凝集素的胞外域。15.根据权利要求12所述的分子，其中该抗原是来自志贺氏菌，并且是选自下组，该组由以下各项组成：IpaD和MxiH。16.根据权利要求1至10中任一项所述的分子，其中该异源氨基酸序列编码抗体或支架。17.根据权利要求16所述的分子，其中该抗体或支架是对抗原有特异性的，该抗原是选自下组，该组由以下各项组成：流感病毒、HIV、巨细胞病毒、登革病毒、黄热病病毒、蜱传脑炎病毒、肝炎病毒、日本脑炎病毒、人乳头状病毒、柯萨奇病毒、单纯疱疹病毒、风疹病毒、腮腺炎病毒、麻疹病毒、狂犬病病毒、脊髓灰质炎病毒、轮状病毒、呼吸道合胞体病毒、埃博拉病毒、基孔肯雅病毒、结核分枝杆菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、大肠杆菌、艰难梭菌、百日咳杆菌、破伤风梭菌、b型...

【专利技术属性】
技术研发人员：R索多耶，I勒加斯特洛瓦，
申请(专利权)人：赛诺菲巴斯德有限公司，
类型：发明
国别省市：法国,FR