细胞表面上非共价含Fc结构域的蛋白质展示的方法技术

本发明专利技术提供用于目标蛋白质(POI)、特别是含Fc结构域的蛋白质(例如抗体)的非共价表面展示的方法。本发明专利技术的方法可用来筛选和选择所需表型的目标蛋白质。本发明专利技术进一步公开了可用于实施本发明专利技术方法的多核苷酸和蛋白质和产生所述多核苷酸和蛋白质的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】细胞表面上非共价含Fc结构域的蛋白质展示的方法及其筛选方法专利
本专利技术涉及宿主细胞表面上蛋白质(例如单克隆抗体)展示及其筛选方法。具体地说，本专利技术涉及宿主细胞表面上展示的抗体或抗体文库或含Fc结构域的融合蛋白的筛选和用于鉴定和选择所需表型的含Fc结构域的蛋白质的方法。本专利技术的方法特别可用于在表达免疫球蛋白或其片段的真核寄主细胞中筛选免疫球蛋白文库。专利技术背景在学术界和制药业，很多资源被投入基于靶标的疗法的单克隆抗体的发现和开发中。在迄今开发的可用技术中，筛选抗体文库的高通量技术使得能够通过亲和力成熟鉴定新的候选分子并快速优化预选择的结合剂。由于新的候选分子的鉴定是一个巨大的驱动性延伸技术，因此新的高效筛选技术的专利技术已被证明是进一步加快抗体发现和发展过程的总体策略的一个关键部分。自80年代中期出现噬菌体展示技术及其应用于抗体展示以来，已涌现出若干体外展示技术。紧接噬菌体展示，有4种主要的展示技术，称为细胞展示、核糖体展示、mRNA展示和DNA展示，其中噬菌体展示为最被认可的一种。噬菌体展示目前是用于展示和选择大批抗体和用于进一步工程改造所选抗体的最普遍方法。抗体通常以所谓的“单价”形式展示，其中抗体-外被蛋白融合基因携带在噬菌粒载体上，通过用辅助噬菌体感染携带噬菌粒的细菌进行展示。最优选这种形式(亦称为3x3形式)，因为在噬菌粒载体中构建文库赋予噬菌粒载体与噬菌体载体相比较高的转化效率，因为它提供对最高的亲和力结合剂的选择，亲合力作用不会使之偏斜(Saggy等(2012)ProteinEng.Des.Sel.25,539-549)。噬菌体抗体展示的最成功应用包括例如重新从非免疫和合成文库中分离高亲和力人抗体(包括针对自身抗原的抗体)，通过体外亲和力成熟产生具有皮摩尔亲和力的高亲和力抗体，并从来自动物或人供体的非免疫和免疫文库发现具有独特性质的抗体(Hogenboom(2005)Nat.Biotech23,1105–1116)。尽管噬菌体抗体展示的优势，但该技术还具有限制其应用的缺点：在大肠杆菌(E.coli)中，功能抗体片段有效分泌到周质间隙通常需要蛋白伴侣和异构酶共表达以防止因有限分泌能力所致的抗体片段的错折叠和聚集(Bothmann和Plückthun(2000),J.Biol.Chem.第275卷(22),17100-17105))。另外，似乎存在针对奇数的半胱氨酸、正电荷的运行和所展示肽内固定位置的某些残基的生物选择，这因此导致抗体片段的固有的偏向性选择。第二最常用的技术是酵母展示，这是一种从组合文库选择并工程改造抗体片段的稳健技术。酵母展示技术对寡聚体分子(例如全长IgG免疫球蛋白)的表达是有利的，因为与细菌表达的抗体相比，抗体不得不通过真核生物的分泌途径，这导致总体较大数目的正确折叠的免疫球蛋白。酵母展示利用若干天然存在的细胞壁锚定蛋白的存在，这可用来通过C端糖基磷脂酰肌醇附着信号(通常称为GPI锚)的附着使异源蛋白质靶向最外面的细胞表面。首先，酵母展示依赖于抗体编码DNA序列与酵母细胞壁甘露糖蛋白(mannoprotein)序列以符合读框的方式遗传融合(Doerner等(2014)，FEBSLetters588，278-287)。用于表面展示的蛋白质库经扩增，届时包括例如a-凝集素、Flo1p和α-凝集素。这其中，最常使用a-凝集素应用系统。A-凝集素是在合适的酵母细胞配对时介导细胞-细胞接触的两种配对型特异性凝集素之一。它由1个核心亚基Aga1p形成，所述核心亚基Aga1p通过2个二硫桥与较小的结合亚基Aga2p连接。由于Aga1p的GPI附着信号所致，核心亚基使Aga复合物共价锚在细胞壁上。由于所需要的C端GPI-附着信号所致，与只允许异源蛋白质的N端融合的单个单元的GPI-锚定蛋白相比，a-凝集素的模块结构此外能够使待展示的异源蛋白质与Aga2p的C端或N端融合。基于Flo1p的系统不同，因为它们可通过与被认为与细胞表面上的糖单元结合的N端絮凝功能结构域融合，非共价地附着并固定异源蛋白质。染色体编码的AGA1和附加体编码的AGA2-融合蛋白的过量表达通常由诱导型Gal10启动子驱动，这说明了在内质网中缔合的两种亚基的化学计量表达水平。半乳糖诱导的表达导致约104–105拷贝的融合蛋白在宿主细胞表面上展示(Doerner等(2014),FEBSLetters588,278-287；Boder和Witrup(1997)Nat.Biotechnol.15,553-557)。通过表位标签或借助其活性(这在抗体的情况下是其与可溶性抗原的结合亲和力)进行表面暴露的融合蛋白的检测。检测通常用各自的生物素化抗原和第二试剂(例如链霉抗生物素缀合的荧光团)或以别的方式标记的抗原进行。在一种方法中，酵母展示被改进，其被称为用于靶结合蛋白的选择的分泌俘获细胞表面展示(secretion-and-capturecell-surfacedisplay)(SECANT™,Rakestraw等(2011)ProteinEngDesSel.Jun;24(6):525-30)。该技术被成功地用于在酵母细胞表面展示全长免疫球蛋白G(IgG)抗体。在SECANT™技术中，目标蛋白质(POI)与小的生物素接纳体肽(BAP)遗传融合，所述生物素接纳体肽(BAP)接着一个TEV蛋白酶切割位点以利于纯化。TEV-BAP肽可与POI的N端或C端融合。在与TEV-BAP标签相对的POI的末端，POI与标签(通常为FLAG标签)遗传融合，整个BAP、POI和FLAG标签基因籍此位于酵母分泌信号，通常工程改造的aMFpp8前导序列、转化酶前导序列或合成前导序列的3’，所述酵母分泌信号接着Kex2蛋白水解切割位点(Rakestraw等(2011)ProteinEngDesSel.Jun;24(6):525-30)。对于POI的选择，POI的基因作为与BirA生物素连接酶和蛋白伴侣共表达的BAP的N端或C端融合物表达。BirA生物素连接酶使POI上的BAP标签生物素化。在分泌时，POI然后被表面定位的抗生物素蛋白结合，并可用荧光团标记的抗表位抗体或荧光团标记的抗原标记用于后续检测和选择。虽然SECANT技术允许分泌和选择复杂分子例如IgG免疫球蛋白，但该技术仍需要POI的遗传修饰和生物素连接酶的共表达，这在筛选和选择过程中增加了额外的步骤。对酵母展示和特别对复杂分子的展示及其在抗体鉴定和成熟中的应用存在持续需求，还存在对降低与鉴定新的抗体候选物的筛选方法有关的成本和时间的持续需要。因此本专利技术的目的是提供在不需要遗传编码的锚蛋白或胞内抗体修饰的情况下允许在宿主细胞表面上展示复杂分子以鉴定目标蛋白质的方法。专利技术概述本专利技术出乎意料地发现用于在宿主细胞表面上展示、检测和选择所需表型的目标蛋白质的方法，本专利技术的方法籍此不需要目标蛋白质的遗传修饰。在第一个实施方案中，本专利技术提供用于在宿主细胞表面展示蛋白质的方法，所述方法包括以下步骤：(a)将编码待在所述宿主细胞表面展示的目标蛋白质的至少一个或多个多核苷酸导入宿主细胞；(b)使所述宿主细胞表面与第一标记接触；(c)使(b)的所述宿主细胞的表面与第二标记接触，第二标记籍此与所述第一标记和由本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于在宿主细胞表面展示蛋白质的方法，所述方法包括：(a) 将编码待在所述宿主细胞表面展示的目标蛋白质的至少一个或多个多核苷酸导入宿主细胞；(b) 使所述宿主细胞表面与第一标记接触；(c) 使(b)的所述宿主细胞表面与第二标记接触，所述第二标记籍此与所述第一标记和由所述至少一个或多个多核苷酸编码的所述目标蛋白质特异地且非共价地结合；(d) 在足以分泌由至少一个或多个多核苷酸编码的所述目标蛋白质的条件下在所述宿主细胞中表达所述至少一个或多个多核苷酸；(e) 使步骤(d)的所述宿主细胞与用于特异性检测被所述第二标记非共价结合的所述目标蛋白质的工具接触和检测在其表面上展示目标蛋白质的宿主细胞。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.10.28 EP 14003649.21.一种用于在宿主细胞表面展示蛋白质的方法，所述方法包括：(a)将编码待在所述宿主细胞表面展示的目标蛋白质的至少一个或多个多核苷酸导入宿主细胞；(b)使所述宿主细胞表面与第一标记接触；(c)使(b)的所述宿主细胞表面与第二标记接触，所述第二标记籍此与所述第一标记和由所述至少一个或多个多核苷酸编码的所述目标蛋白质特异地且非共价地结合；(d)在足以分泌由至少一个或多个多核苷酸编码的所述目标蛋白质的条件下在所述宿主细胞中表达所述至少一个或多个多核苷酸；(e)使步骤(d)的所述宿主细胞与用于特异性检测被所述第二标记非共价结合的所述目标蛋白质的工具接触和检测在其表面上展示目标蛋白质的宿主细胞。2.权利要求1的方法，其中由至少一个或多个多核苷酸编码的蛋白质是单体或多聚体。3.权利要求1或权利要求2的方法，其中由至少一个或多个多核苷酸编码的蛋白质包含信号肽。4.权利要求1-3中任一项的方法，其中所述第一标记与所述宿主细胞的表面共价结合。5.权利要求1-4中任一项的方法，其中所述第一标记是生物素或生物素衍生物。6.权利要求1-5中任一项的方法，其中所述第二标记是另外的蛋白质或另外的多肽。7.权利要求6的方法，其中所述第二标记另外的蛋白质是多聚体蛋白质（multimericprotein）。8.权利要求1-7中任一项的方法，其中第二是或包含与抗生物素蛋白、链霉抗生物素、neutravidin融合的A蛋白、L蛋白、G蛋白、A-G蛋白融合物、A蛋白的结构域E、D、A、B之一或其序列变体。9.权利要求1-8中任一项的方法，其中所述宿主细胞选自哺乳动物、酵母或昆虫细胞。10.权利要求1-9中任一项的方法，其中所述酵母宿主细胞选自酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、多形汉逊酵母(Hansenulapolymorpha)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)、许旺酵母(Schwanniomycesoccidentalis)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyceslactis)、亚罗解脂酵母(Yarrowialipolytica)和巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)。11.权利要求1-9中任一项的方法，其中所述哺乳动物宿主细胞选自HEK293、HEK293T、HEK293E、HEK293F、NS0、per.C6、MCF-7、HeLa、Cos-1、Cos-7、PC-12、3T3、Vero、vero-76、PC3、U87、SAOS-2、LNCAP、DU145、A431、A549、B35、H1299、HUVEC、Jurkat、MDA-MB-231、MDA-MB-468、MDA-MB-435、Caco-2、CHO、CHO-K1、CHO-B11、CHO-DG44、BHK、AGE1.HN、Namalwa、WI-38、MRC-5、HepG2、L-929、RAB-9、SIRC、RK13、11B11、1D3、2.4G2、A-10、B-35、C-6、F4/80、IEC-18、L2、MH1C1、NRK、NRK-49F、NRK-52E、RMC、CV-1、BT、MDBK、CPAE、MDCK.1、MDCK.2和D-17。12.权利要求1-9中任一项的方法，其中所述昆虫细胞选自Hi5、Sf9、Sf21、S2和BTI-TN-5B1-4。13.权利要求1-12中任一项的方法，其中用于特异性检测所述目标蛋白质的所述工具选自抗体或抗体片段、量子点、酶、荧光团或嵌入染料和神经节苷脂。14.权利要求1-13中任一项的方法，其中用于特异性检测所述蛋白质的所述工具是任选与另外的标记偶联的以下之一：多克隆抗体、单克隆抗体、scFv-Fc、scFv、(Fab’)2、Fab、微型抗体、双抗体或VHH抗体。15.权利要求1-14中任一项的方法，其中所述方法进一步包括选择宿主细胞。16.权利要求15中任一项的方法，其中所述选出的宿主细胞展示表型改变的目标蛋白质。17.权利要求16的方法，其中所述改变的表型是表面表达水平、蛋白质稳定性、蛋白质折叠或亲和力之一。18.权利要求1-17中任一项的方法，其中所述改变的表型通过将步骤(e)的所述宿主细胞与参比样品进行比较来确定。19.权利要求1-18中任一项的方法，其中由步骤(a)的至少一个或多个多核苷酸编码的所述目标蛋白质包含至少一个Fc结构域同二聚体。20.权利要求19的方法，其中所述至少一个Fc结构域同二聚体是人IgG1、人IgG2、鼠IgG2a、鼠IgG2b或鼠IgG3之一或其序列变体。21.权利要求19或权利要求20的方法，其中所述含Fc结构域的蛋白质是N端Fc结构域融合蛋白、C端Fc结构域融合蛋白或抗体。22.权利要求21的方法，其中所述抗体是单克隆抗体。23.权利要求22的方法，其中所述单克隆抗体是鼠单克隆抗体、小鼠-人嵌合单克隆抗体、人源化单克隆抗体或人单克隆抗体。24.权利要求1-23中任一项的方法，其中所述第二...

【专利技术属性】
技术研发人员：L里尔，S贝克，R京特，B霍克，D黑尔曼，M托伊斯特阿奇图夫，S克拉，
申请(专利权)人：默克专利股份公司，
类型：发明
国别省市：德国,DE