一种靶向CD19的嵌合抗原受体修饰的T淋巴细胞制造技术

本发明专利技术提供一种靶向CD19的嵌合抗原受体修饰的T淋巴细胞，是使用氨基酸序列为SEQ ID NO:1的嵌合抗原修饰T淋巴细胞制备的。本发明专利技术通过筛选，最终得到一个全新的、靶向CD19的嵌合抗原受体序列。构建的嵌合抗原受体修饰的T细胞，可用于治疗CD19阳性的B细胞恶性肿瘤。

【技术实现步骤摘要】
一种靶向CD19的嵌合抗原受体修饰的T淋巴细胞
本专利技术属于细胞工程
，具体涉及一种靶向CD19的嵌合抗原受体修饰的T淋巴细胞。
技术介绍
B淋巴细胞瘤是起源于造血系统的最常见的恶性肿瘤。目前，多种B淋巴细胞恶性肿瘤应用传统疗法难以治愈。此外，传统的治疗方法具有多种副作用。例如，异体骨髓移植后，会引起移植物抗宿主病(GVDH)，从而导致骨髓移植的失败。近年来，嵌合抗原受体修饰的T细胞(CAR-T)技术的发展给一些B细胞表面分化抗原相关疾病的治疗带来希望；其中靶向CD19的CAR-T细胞疗法已进入临床试验阶段，一些患者达到了完全缓解的效果。该疗法在急性白血病和非霍奇金淋巴瘤的治疗上有着显著的疗效，目前被认为是最有前景的肿瘤治疗方式之一。目前，CAR-T技术已发展到第三代，但第二代在临床治疗上最为常见。CAR-T技术的CAR分子由胞外抗原结合区、跨膜区和胞内区组成。胞外抗原结合区由信号肽和靶抗原的单链抗体(scFV)片段组成，第二代胞内区由一个共刺激分子(主要为CD28或CD137分子)和信号传导区(CD3ζ)组成。第三代胞内区则由两个共刺激分子和信号传导区组成。随着该项技术的发展，修饰性T细胞(CAR-T)的疗效和机体内的持久性将得到更好的提高。由于CAR-T抗原的靶向性非常强，无法区分表达相应抗原的肿瘤细胞和正常细胞，因此针对表达相应抗原的肿瘤细胞和正常细胞，都具有攻击性，可能会导致靶向细胞毒性的产生。因此很有必要开发出靶向肿瘤特异性抗原的有效且安全性高的抗体片段，用于构建新的CAR分子，进而尽可能降低靶向毒性对机体带来的危险。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种靶向CD19的嵌合抗原受体修饰的T淋巴细胞，从而降低CAR-T的靶向毒性，以弥补现有技术之不足。本专利技术首先提供一种嵌合抗原，其氨基酸序列为SEQIDNO:1；编码上述嵌合抗原的核苷酸片段，其序列为SEQIDNO:2；上述的嵌合抗原用于修饰T淋巴细胞；本专利技术在一个方面提供一种使用上述嵌合抗原修饰的T淋巴细胞，其构建步骤如下：1)人外周血PBMC的分离采集人外周血50ml,使用淋巴细胞分离液分离获得单个核细胞(PBMC)；该群细胞在CD3/CD28抗体和IL-2作用下，激活得到大量增殖的T细胞。同时提取PBMC中总RNA，逆转录为PCR反应的模板cDNA。2)构建重组质粒将编码上述嵌合抗原的核苷酸片段插入pLVX-IRES-Neo载体中，获得重组嵌合抗原受体表达质粒；本专利技术的嵌合抗原受体，优选的是慢病毒表达载体pLVX-IRES-Neo。3)慢病毒制备：将步骤2)构建的重组质粒和病毒包装质粒转染进入293T细胞中，获得携带上述嵌合抗原的慢病毒；其一种具体操作方法如下：复苏293T细胞，消化传代至第三代。T100B包被培养板后，接种293T细胞；将重组质粒和病毒包装质粒共转染293T细胞，转染后48h、72h收集病毒液。4)修饰性T细胞的获得使用步骤3)制备的慢病毒感染T细胞，获得修饰性T细胞所述修饰性T细胞制备的过程中，其一种具体步骤如下：分离外周血，获得PBMC；通过CD3/CD28抗体磁珠作用，得到特异性增殖的T细胞，加入浓缩好的慢病毒来感染T细胞；慢病毒与T细胞混合后，再加入polyberen进行感染，最终获得修饰性T细胞。本专利技术通过筛选，最终得到一个全新的、靶向CD19的嵌合抗原受体序列。该嵌合抗原受体经过密码子优化，插入慢病毒表达载体pLVX-IRES-Neo(空载)中，构成抗人CD19分子的重组表达质粒。该质粒利用慢病毒包装体系(Lenti-XPackagingSingleShots，VSVG)，获得高滴度的慢病毒；T100B包被后进行T细胞铺板，再利用慢病毒感染，获得修饰性的T细胞。多次实验表明，T100B可显著提高慢病毒对T细胞的感染率。利用流式细胞术，检测嵌合抗原受体的表达效率；并将构建成功的修饰性T细胞与B细胞系来源的Raji肿瘤细胞共培养，前者对Raji细胞具有显著的杀伤性。由此可见，构建的嵌合抗原受体修饰的T细胞，可用于治疗CD19阳性的B细胞恶性肿瘤。附图说明图1为PLV-CAR19重组表达载体示意图。图2为CAR19重组质粒的限制性内切酶EcoRI/BamHI双酶切电泳鉴定图。图3为PLV-CAR19重组表达质粒的部分测序结果峰值图。图4为靶向CD19的嵌合抗原受体的基因结构示意图。图5为CAR19修饰性T淋巴细胞与Raji共培养后的杀瘤检测图。具体实施方式为了对本专利技术所作进一步说明，下面将结合附图说明和具体实施方式做分别介绍。本专利技术的实现方式并不仅限于实施方式所公开的内容与技术，因此凡对本方案技术所进行的等同替换，均在本专利技术的保护范围之内。实施例1：人外周血单个核细胞(PBMC)分离与T细胞扩增1.1人外周血PBMC的分离1)采集供者外周血50ml，800g，离心10min。离心后可观察到分层现象。上层为血浆层，中间层为白膜层，最下端为红细胞层。2)用吸液管缓慢收集血浆层，56度灭活30min。3)淋巴细胞分离液分离白膜层：使用吸管小心抽吸白膜层细胞，加入PBS中，两者完全混匀；将淋巴分离液的加入15ml离心管中，再等体积加入PBS混合液。700g，离心15min。4)洗涤PBMC：离心后小心抽吸离心管中间的白膜层细胞，加入25mlPBS混匀清洗一次。离心后，弃PBS；再加入培养基25ml重悬，重复清洗一次细胞。5)弃去培养基，加入新的培养基重悬PBMC细胞。1.2T细胞激活与扩增1)PBMC分离：将步骤1.1最终分离的PBMC全部加入T175cm2培养瓶，移入CO2培养箱中。2)2h后取出培养瓶，轻轻晃动，使沉降于底部的悬浮细胞浮起，培养瓶倾斜，移液器吸取细胞悬浮液转入新的培养瓶中，少许培养基清洗培养瓶将悬浮细胞全部收集。3)向新的培养瓶中加CD3/CD28磁珠，并加入IL-2(100U/ml),混匀后移入培养箱中。4)第5日去磁珠，定期补液。取激活的T细胞，使用抗体CD4+和CD8+单克隆抗体染色，流式细胞仪上机鉴定激活的T细胞的分型。1.3RT-PCR获得PBMC中cDNA1)Trizol提取PBMC中总RNA:取2x106个PBMC细胞，加入1mlTrizol。使用上海生工生物工程股份有限公司的Q-10柱式Trizol总RNA抽提试剂盒抽提PBMC中的总RNA。2)反转录RNA获得cDNA:使用上海生工生物工程股份有限公司的AMV第一链cDNA合成试剂盒中OligodTPrimer反转录RNA。反转录体系如下：逆转录反应体系20μlRNA样品3μlOligo-dTprimers1μlRNasefreeddH208μl5×RTBuffer4μlRNaseInhibitor(40U/μl)1μldNTPs(10mM)2μlAMVReverseTranscriptase2μl反转录程序如下：cDNA合成42℃60min终止反应85℃5min(酶失活)处理后，冰上放置或-20度保存实施例2:嵌合抗原CAR19重组载体的构建2.1抗CD19单链抗体(scFV)基因序列的获得人CD19蛋白免疫小鼠后纯化得到其抗体片段，对其进行氨基酸测序，之后进行密码子优化，得到其核苷酸序列。修饰并构建为抗CD19的单链抗本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种嵌合抗原，所述的嵌合抗原的氨基酸序列为SEQ ID NO:1。

【技术特征摘要】
1.一种嵌合抗原，所述的嵌合抗原的氨基酸序列为SEQIDNO:1。2.核苷酸片段，所述的核苷酸片段编码权利要求1所述的嵌合抗原。3.如权利要求2所述的核苷酸片段，其特征在于，所述的核苷酸片段的序列为SEQIDNO:2。4.权利要求1所述的嵌合抗原在修饰T淋巴细胞中的应用。5.一种嵌合抗原受体修饰的T淋巴细胞，所述的嵌合抗原受体修饰的T淋巴细胞是使用权利要求1所述的嵌合抗原进行了修饰。6.如权利要求5所述的嵌合抗原受体修饰的T淋巴细胞，其特征在于，所述的嵌合抗原修饰的T淋巴细胞，其制备方法如下：1)人外周血PBMC的分离采集人外周血50ml,使用淋巴细胞分离液分离获得单个核细胞；该群细胞在CD3/CD28抗体和IL-2作用下，激活得到大量增殖的T细胞；同时提取PBMC中总RNA...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘燕丽，张道强，刘传杰，徐矫健，刘鹏飞，葛淑娟，王玉娟，
申请(专利权)人：青岛麦迪赛斯医疗技术有限公司，
类型：发明
国别省市：山东,37