利用蛋白特征多肽鉴定牛肉掺伪方法技术

本发明专利技术涉及利用蛋白特征多肽鉴定牛肉掺伪方法，可有效解决牛肉中掺假，以保证牛肉的纯质量问题，方法是，肉制品用乙醇、乙醚进行洗涤预处理；将纯牛肉与非标混合肉按不同比例混匀，制成不同比例的掺假牛肉；称取生肉、熟肉、预处理后的肉制品，加入蛋白提取液，混悬后冰浴，离心，孵育，测定吸光度值；称取生肉、熟肉、预处理后的肉制品，加入蛋白提取液，匀浆，冰上孵育，加丙酮离心，固体用丙酮洗涤，用尿素/碳酸氢铵溶液溶解，加入DTT、IAA反应，酶切，得动物肉多肽溶液，过滤净化除盐，上液相色谱‑四级杆/静电场轨道阱质谱测定；将HPLC‑Q/Exactive采集到的数据，同时采用Sieve 2.0和用Maxquant 1.5.3.8软件进行分析测定；本发明专利技术方法新颖独特，操作使用方便，准确率高。

【技术实现步骤摘要】
利用蛋白特征多肽鉴定牛肉掺伪方法
本专利技术涉及防伪，特别是一种利用蛋白特征多肽鉴定牛肉掺伪方法。
技术介绍
牛肉是人们喜欢的食品，而且资源有限，正因如此，市场上经常会出现牛肉掺假的现象，以牟取非法的利益，但由于受宗教信仰、营养需求等多种因素的影响，牛肉中不允许掺假，但事实并非如此，掺假牛肉时有发生，那么如何解决牛肉中掺假成份的鉴定已成为食品安全面临的焦点问题；目前，检测手段主要有依靠感官、ELISA和PCR等方法，感官法受主观因素影响结果可靠性差；ELISA技术不能用于加工食品的掺伪鉴别，且由于抗体不具有物种特异性、无法对混合肉的种源进行辨别，需要其他手段辅助检测；PCR技术可能会出假阳性或假阴性结果且无法准确定量掺假含量。因此如何解决牛肉中掺假防伪是需要认真解决的技术问题。
技术实现思路
针对上述情况，为克服现有技术之缺陷，本专利技术之目的就是提供一种利用蛋白特征多肽鉴定牛肉掺伪方法，可有效解决牛肉中掺假，以保证牛肉的纯质量问题。本专利技术解决的技术方案是，包括以下步骤：(1)、制备动物生肉、熟肉、肉制品：所述的动物为牛、马、猪、兔、鸡、鸭；(2)动物肉的预处理：生肉和熟肉不做预处理，肉制品用乙醇、乙醚进行洗涤预处理；(3)、掺假牛肉的制备：A、非标混合肉的制作：所述的非标准肉是猪肉、马肉、兔肉、鸡肉或鸭肉，将非标准肉捣碎混合均匀，得非标混合肉；B、制作不同掺假非标混合肉的牛肉：将标准牛肉(纯牛肉)与非标混合肉按不同质量百分比混合均匀，制成不同比例的掺假牛肉；(4)、BCA法测定蛋白含量：方法是，分别称取生肉、熟肉、预处理后的肉制品作为样品，分别加入蛋白提取液，混悬后冰浴，离心，孵育，取出冷却至室温，测定吸光度值；(5)、肉蛋白的酶切：分别称取生肉、熟肉、预处理后的肉制品作样品，分别加入蛋白提取液，匀浆，冰上孵育，重复3次；在冰上静置后加入预冷的丙酮，震荡摇匀，静置，再离心，弃上清液，用丙酮重悬后再次离心，弃掉上清，剩余固体用丙酮洗涤，将固体残渣挥去溶剂；然后用尿素/碳酸氢铵溶液重新溶解固体，加入DTT储备液反应，然后加入IAA储备液避光反应；加入碳酸氢铵溶液，计算肉蛋白浓度，加入Trypsin，酶切过夜，取出，加入甲酸终止反应，得动物肉多肽溶液；(6)、净化除盐：HLB柱依次用甲醇、水活化，将动物肉多肽溶液离心，分别取上清液上载至HLB柱中，待样液全部流出后用水淋洗，使柱体保持抽干，再用甲醇洗脱，将收集的洗脱液于氮气流下浓缩至干，加入乙腈-甲酸溶解残渣，涡旋混匀，超声，过滤净化除盐；(7)、上液相色谱-四级杆/静电场轨道阱质谱(HPLC-Q/Exactive)测定动物肉中特征多肽：净化除盐后的动物肉多肽溶液上液相色谱-四级杆/静电场轨道阱质谱(HPLC-Q/Exactive)测定；将HPLC-Q/Exactive采集到的数据，同时采用Sieve2.0和用Maxquant1.5.3.8软件进行分析测定；Sieve2.0数据分析条件：将牛肉设为参比组，猪肉、鸡肉、鸭肉和马肉设为对照组，设定目标为蛋白组学差异性分析，质量准确度阈值设为10ppm，进行Align和Frame分析；Maxquant1.5.3.8条件：肉类样品进行非标记定量(LFQ)分析，检索数据库为牛、猪、鸡、兔、马物种的Uniprot全库，最多漏切位点设为2，可变修饰为氧化(蛋氨酸)、乙酰化(N-端)，固定修饰为脲甲基修饰(半胱氨酸)；勾选异亮氨酸等于亮氨酸设置(I＝L)，为了获得尽可能多的多肽定量信息，选择所有定量肽段信息选项；其他参数为Maxquant默认值；利用非标记定量的结果，选取每个物种中独有的多肽信息，去掉含有MissCleavage的多肽，获得动物肉特征多肽，实现牛肉掺伪鉴别。本专利技术方法新颖独特，操作使用方便，准确率高，有效解决肉类中的掺假问题，是肉类掺假鉴定上的创新，经济和社会效益显著。具体实施方式以下结合具体情况对本专利技术的具体实施方式作详细说明。本专利技术在具体实施中，包括以下步骤：(1)、制备动物生肉、熟肉、肉制品：所述的动物为牛、马、猪、兔、鸡、鸭；生肉制备：将市场购得的生鲜肉切成小块置于-80℃冰箱中冷冻；熟肉制备：将生鲜肉在190℃加热1h，成熟肉，真空至干；肉制品制备：煎炸肉：将生鲜肉放入高温植物油油中煎炸5min，取出后冷却至室温；腌肉：将生鲜肉加入氯化钠腌制24h，取出后用清水清洗，真空至干；肉肠：将生鲜肉中按常规方法加入辣椒面、花椒粉、白酒，装肠；肉泥：将生鲜肉加入20％氯化钠，4℃腌制4天，加水放置加热板上加热搅拌20min，再于高压蒸锅121℃蒸制15min；(2)动物肉的预处理：生肉和熟肉不做预处理，肉制品每2g用体积浓度95％乙醇洗2次，每次20mL，再用乙醚洗2次，每次10mL，然后将溶剂蒸发干，置于-80℃冰箱中；(3)、掺假牛肉的制备：A、非标混合肉的制作：所述的非标准肉是猪肉、马肉、兔肉、鸡肉或鸭肉，将非标准肉各100g捣碎混合均匀，得非标混合肉；B、制作不同掺假非标混合肉的牛肉：将标准牛肉(纯牛肉)与非标混合肉混合均匀，制成掺假质量比例分别为0.1％、0.2％、0.5％、1.0％、2.0％、5.0％、10％、20％、40％、60％、80％、90％、95％、100％的掺假牛肉；(4)、BCA法测定蛋白含量：方法是，分别称取生肉、熟肉、预处理后的肉制品100g作为样品，分别加入1000μL蛋白提取液，混悬后冰浴10min，4℃下13000r/min转速下离心10min，37℃孵育30min，取出冷却至室温，于562nm波长下，用酶标仪测定吸光度值；所述的蛋白提取液是：取50mL1MTrisHCl，37.5mL4MNaCl，4mL0.5MEDTA，10mLNP-40，10mL10％SDS，用水定容至1000mL；测定蛋白浓度的计算公式为：取10次样品测定的平均数，见下表1：表1肉平均蛋白浓度(n＝10)物种牛猪兔马鸡鸭浓度(μg/mL)631360526181605058415947(5)、肉蛋白的酶切：分别称取生肉、熟肉、预处理后的肉制品300mg作样品，分别加入1000μL蛋白提取液，以匀浆机上最大速度匀浆20s，在冰上孵育40s，重复3次；在冰上静置10min，然后加入样品3倍体积的-20℃冰箱预冷过夜的丙酮，震荡摇匀，-20℃静置2h，再在15000r/min离心10min，弃掉上清液，用丙酮重悬后再次离心，弃掉上清，剩余固体用丙酮洗3次，将固体残渣通风自然挥发掉多余的溶剂；然后用200μL的8M尿素/50mM碳酸氢铵溶液重新溶解固体，加入1M的DTT储备液使浓度保持在10mM，在56℃下反应40min，然后加入0.5M的IAA储备液使浓度保持在50mM，常温下避光反应40min；加入200μL碳酸氢铵溶液，根据步骤(4)计算公式1得到的肉蛋白浓度，按Trypsin浓度：蛋白浓度＝1:20的比例加入Trypsin，37℃恒温培养箱中酶切过夜，取出，加入2μL甲酸终止反应，得动物肉多肽溶液；所述的1M的DTT储备液是：称取0.154g二硫代苏糖醇，加入1mL水溶解，配制成1mol/L二硫代苏糖醇水溶液；所述的0.5mol/L的IAA储备液是：称取0.185g碘乙酰胺，加入0.5mL水溶解，配本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种利用蛋白特征多肽鉴定牛肉掺伪方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)、制备动物生肉、熟肉、肉制品：所述的动物为牛、马、猪、兔、鸡、鸭；(2)动物肉的预处理：生肉和熟肉不做预处理，肉制品用乙醇、乙醚进行洗涤预处理；(3)、掺假牛肉的制备：A、非标混合肉的制作：所述的非标准肉是猪肉、马肉、兔肉、鸡肉或鸭肉，将非标准肉捣碎混合均匀，得非标混合肉；B、制作不同掺假非标混合肉的牛肉：将标准牛肉与非标混合肉按不同质量百分比混合均匀，制成不同比例的掺假牛肉；(4)、BCA法测定蛋白含量：方法是，分别称取生肉、熟肉、预处理后的肉制品作为样品，分别加入蛋白提取液，混悬后冰浴，离心，孵育，取出冷却至室温，测定吸光度值；(5)、肉蛋白的酶切：分别称取生肉、熟肉、预处理后的肉制品作样品，分别加入蛋白提取液，匀浆，冰上孵育，重复3次；在冰上静置后加入预冷的丙酮，震荡摇匀，静置，再离心，弃上清液，用丙酮重悬后再次离心，弃掉上清，剩余固体用丙酮洗涤，将固体残渣挥去溶剂；然后用尿素/碳酸氢铵溶液重新溶解固体，加入DTT储备液反应，然后加入IAA储备液避光反应；加入碳酸氢铵溶液，计算肉蛋白浓度，加入Trypsin，酶切过夜，取出，加入甲酸终止反应，得动物肉多肽溶液；(6)、净化除盐：HLB柱依次用甲醇、水活化，将动物肉多肽溶液离心，分别取上清液上载至HLB柱中，待样液全部流出后用水淋洗，使柱体保持抽干，再用甲醇洗脱，将收集的洗脱液于氮气流下浓缩至干，加入乙腈‑甲酸溶解残渣，涡旋混匀，超声，过滤净化除盐；(7)、上液相色谱‑四级杆/静电场轨道阱质谱测定动物肉中特征多肽：净化除盐后的动物肉多肽溶液上液相色谱‑四级杆/静电场轨道阱质谱测定；将HPLC‑Q/Exactive采集到的数据，同时采用Sieve 2.0和用Maxquant 1.5.3.8软件进行分析测定；Sieve2.0数据分析条件：将牛肉设为参比组，猪肉、鸡肉、鸭肉和马肉设为对照组，设定目标为蛋白组学差异性分析，质量准确度阈值设为10ppm，进行Align和Frame分析；Maxquant 1.5.3.8条件：肉类样品进行非标记定量分析，检索数据库为牛、猪、鸡、兔、马物种的Uniprot全库，最多漏切位点设为2，可变修饰为氧化、乙酰化，固定修饰为脲甲基修饰；勾选异亮氨酸等于亮氨酸设置I＝L，为了获得尽可能多的多肽定量信息，选择所有定量肽段信息选项；其他参数为Maxquant默认值；利用非标记定量的结果，选取每个物种中独有的多肽信息，去掉含有Miss Cleavage的多肽，获得动物肉特征多肽，实现牛肉掺伪鉴别。...

【技术特征摘要】
1.一种利用蛋白特征多肽鉴定牛肉掺伪方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)、制备动物生肉、熟肉、肉制品：所述的动物为牛、马、猪、兔、鸡、鸭；(2)动物肉的预处理：生肉和熟肉不做预处理，肉制品用乙醇、乙醚进行洗涤预处理；(3)、掺假牛肉的制备：A、非标混合肉的制作：所述的非标准肉是猪肉、马肉、兔肉、鸡肉或鸭肉，将非标准肉捣碎混合均匀，得非标混合肉；B、制作不同掺假非标混合肉的牛肉：将标准牛肉与非标混合肉按不同质量百分比混合均匀，制成不同比例的掺假牛肉；(4)、BCA法测定蛋白含量：方法是，分别称取生肉、熟肉、预处理后的肉制品作为样品，分别加入蛋白提取液，混悬后冰浴，离心，孵育，取出冷却至室温，测定吸光度值；(5)、肉蛋白的酶切：分别称取生肉、熟肉、预处理后的肉制品作样品，分别加入蛋白提取液，匀浆，冰上孵育，重复3次；在冰上静置后加入预冷的丙酮，震荡摇匀，静置，再离心，弃上清液，用丙酮重悬后再次离心，弃掉上清，剩余固体用丙酮洗涤，将固体残渣挥去溶剂；然后用尿素/碳酸氢铵溶液重新溶解固体，加入DTT储备液反应，然后加入IAA储备液避光反应；加入碳酸氢铵溶液，计算肉蛋白浓度，加入Trypsin，酶切过夜，取出，加入甲酸终止反应，得动物肉多肽溶液；(6)、净化除盐：HLB柱依次用甲醇、水活化，将动物肉多肽溶液离心，分别取上清液上载至HLB柱中，待样液全部流出后用水淋洗，使柱体保持抽干，再用甲醇洗脱，将收集的洗脱液于氮气流下浓缩至干，加入乙腈-甲酸溶解残渣，涡旋混匀，超声，过滤净化除盐；(7)、上液相色谱-四级杆/静电场轨道阱质谱测定动物肉中特征多肽：净化除盐后的动物肉多肽溶液上液相色谱-四级杆/静电场轨道阱质谱测定；将HPLC-Q/Exactive采集到的数据，同时采用Sieve2.0和用Maxquant1.5.3.8软件进行分析测定；Sieve2.0数据分析条件：将牛肉设为参比组，猪肉、鸡肉、鸭肉和马肉设为对照组，设定目标为蛋白组学差异性分析，质量准确度阈值设为10ppm，进行Align和Frame分析；Maxquant1.5.3.8条件：肉类样品进行非标记定量分析，检索数据库为牛、猪、鸡、兔、马物种的Uniprot全库，最多漏切位点设为2，可变修饰为氧化、乙酰化，固定修饰为脲甲基修饰；勾选异亮氨酸等于亮氨酸设置I＝L，为了获得尽可能多的多肽定量信息，选择所有定量肽段信息选项；其他参数为Maxquant默认值；利用非标记定量的结果，选取每个物种中独有的多肽信息，去掉含有MissCleavage的多肽，获得动物肉特征多肽，实现牛肉掺伪鉴别。2.根据权利要求1所述的利用蛋白特征多肽鉴定牛肉掺伪方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)、制备动物生肉、熟肉、肉制品：所述的动物为牛、马、猪、兔、鸡、鸭；生肉制备：将市场购得的生鲜肉切成小块置于-80℃冰箱中冷冻；熟肉制备：将生鲜肉在190℃加热1h，成熟肉，真空至干；肉制品制备：煎炸肉：将生鲜肉放入高温植物油油中煎炸5min，取出后冷却至室温；腌肉：将生鲜肉加入氯化钠腌制24h，取出后用清水清洗，真空至干；肉肠：将生鲜肉中按常规方法加入辣椒面、花椒粉、白酒，装肠；肉泥：将生鲜肉加入20％氯化钠，4℃腌制4天，加水放置加热板上加热搅拌20min，再于高压蒸锅121℃蒸制15min；(2)动物肉的预处理：生肉和熟肉不做预处理，肉制品每2g用体积浓度95％乙醇洗2次，每次20mL，再用乙醚洗2次，每次10mL，然后将溶剂蒸发干，置于-80℃冰箱中；(3)、掺假牛肉的制备：A、非标混合肉的制作：所述的非标准肉是猪肉、马肉、兔肉、鸡肉或鸭肉，将非标准肉各100g捣碎混合均匀，得非标混合肉；B、制作不同掺假非标混合肉的牛肉：将标准牛肉与非标混合肉混合均匀，制成掺假质量比例分别为0.1％、0.2％、0.5％、1.0％、2.0％、5.0％、10％、20％、40％、60％、80％、90％、95％、100％的掺假牛肉；(4)、BCA法测定蛋白含量：方法是，分别称取生肉、熟肉、预处理后的肉制品100g作为样品，分别加入1000μL蛋白提取液，混悬后冰浴10min，4℃下13000r/min转速下离心10min，37℃孵育30min，取出冷却至室温，于562nm波长下，用酶标仪测定吸光度值；所述的蛋白提取液是：取50mL1MTrisHCl，37.5mL4MNaCl，4mL0.5MEDTA，10mLNP-40，10mL10％SDS，用水定容至1000mL；测定蛋白浓度的计算公式为：取10次样品测定的平均数，见下表1：表1肉平均蛋白浓度(n＝10)物种牛猪兔马鸡鸭浓度(...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨冀州，祝伟霞，徐超，刘亚风，赵芳，张淑霞，杨志聪，
申请(专利权)人：河南出入境检验检疫局检验检疫技术中心，
类型：发明
国别省市：河南,41