一种快速筛查鉴别赤潮藻中多种麻痹性贝毒素的方法技术

一种快速筛查鉴别赤潮藻中多种麻痹性贝毒素的方法：称取一定量的赤潮藻藻体样品，置于离心管中，加入一定量的提取溶剂，采用细胞粉碎仪或藻体研磨法破碎，再进行若干麻痹性贝毒素提取，合并提取液；离心分离除去沉淀，吸取上清液经微孔滤膜过滤，注入样品瓶中，备用；采用高效液相色谱‑高分辨率质谱法对赤潮藻粗提液中的痹性贝毒素进行分离分析；通过与赤潮藻常见麻痹性贝毒素精确分子质量相关信息比对，实现赤潮藻中多种常见麻痹性贝毒素的快速鉴别。可用于海洋环境管理部门快速确定赤潮藻中是否含有麻痹性贝毒素，进一步判断海区贝类毒素对水产品影响，保障水产品消费安全。

【技术实现步骤摘要】
一种快速筛查鉴别赤潮藻中多种麻痹性贝毒素的方法
本专利技术涉及一种赤潮藻鉴别方法，特别是一种针对海洋赤潮藻中多种麻痹性贝毒素快速筛查鉴别的方法。
技术介绍
近年来，随着海洋环境污染日益加重，赤潮发生频率日趋增大，由赤潮毒素致人类中毒和死亡事件屡见不鲜。麻痹性贝毒素（PSP）是赤潮毒素中毒性最大、分布最广、发生毒害事件最多、影响人类最为严重的一类毒素。麻痹性贝毒素是一种神经毒素,能阻碍神经冲动的传导,使中枢神经和末梢神经受到抑制，食入少量的痹性贝毒素即可引起神经系统的疾病，如颤抖、兴奋，严重时会导致呼吸系统麻痹甚至死亡。因此，建立快速、准确检测赤潮藻中麻痹性贝毒素的方法对人类健康和海洋生态环境保护都有非常重要的意义。目前，现有技术主要采用形态学方法，通过鉴别赤潮藻的种类来判断是否是产毒赤潮，然而，产毒赤潮藻种类繁多，即使是同一类产毒藻，在不同海域、不同生长条件下产毒量和产毒种类也会发生巨大变化，因此，急需开发针对赤潮藻中多种痹性贝毒素快速筛选和鉴别的高效方法。现有技术中有用小白鼠生物测定法测定麻痹性贝类毒素。该方法取健康雄性小鼠进行腹腔注射毒素样品，对比注射样品，标准品和空白毒素的小鼠出现的症状，以运动和呼吸停止判断死亡，记录死亡时间。小鼠死亡后暴露胸腔观察心脏搏动情况，记录维持搏动的时间。该方法的缺陷在于误差大，重现性差，灵敏度低，实验繁复，不能确定样品中毒素结构。现有技术中还有使用高效液相色谱-低分辨率质谱法测定麻痹性贝类毒素。该方法以标准麻痹性贝类毒素样品的特征质谱图，计算标准毒素特征峰面积，制作标准曲线。对比样品中特征质谱图和特征峰面积，计算样品中毒素含量。其缺点是每次只能对照特征质谱图筛选特定的麻痹性贝类毒素，不能筛选鉴别赤潮藻中的非目标性及无痹性贝毒素标准的痹性贝毒素。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种针对海洋赤潮藻中多种麻痹性贝毒素快速筛查鉴别的方法，该方法可以实现快速准确的筛查鉴别多种麻痹性贝毒素，为赤潮灾害应急监测、检测提供技术支撑。本专利技术所要解决的技术问题是通过以下的技术方案来实现的。本专利技术是一种快速筛查鉴别赤潮藻中多种麻痹性贝毒素的方法，其特点是，其步骤如下：（1）称取适量的赤潮藻藻体样品，置于离心管中，加入适量的提取溶剂，采用细胞粉碎仪或藻体研磨法破碎，再进行若干麻痹性贝毒素提取，合并提取液；合并液离心分离除去沉淀，吸取上清液经微孔滤膜过滤，粗提液注入样品瓶中，备用；（2）采用高效液相色谱-高分辨率质谱法对赤潮藻粗提液中的痹性贝毒素进行分离分析；（3）通过与赤潮藻常见麻痹性贝毒素精确分子质量相关信息比对：相关信息包括毒素化合物分子式、正负模式准分子离子峰理论精确质量数以及主要碎片峰和元素组成，实现赤潮藻中多种常见麻痹性贝毒素的快速鉴别。优选的赤潮藻藻体中痹性贝毒素提取方法包括：回流提取法、微波提取法、超声提取法、微波-回流提取法、超声-回流提取法。优选的高效液相色谱-高分辨率质谱法中的色谱分离方法包括：反相高效液相色谱法、亲水作用色谱法、离子色谱法、排阻色谱法；采用的高分辨质谱方法包括飞行时间质谱法、静电场轨道阱质谱法、傅里叶变换质谱、磁质谱。本专利技术所述的一种快速筛查鉴别赤潮藻中多种麻痹性贝毒素的方法，其优选的具体步骤如下：（1）对照品溶液的配制：选择麻痹性贝毒素标准溶液包括：CRM-STX-e、CRM-NEO-b、CRM-GTX1＆4-c、CRM-GTX2＆3-c、CRM-dcGTX2＆3-c、CRM-C1＆2；将痹性贝毒素标准溶液用0.1mol/LHAC稀释成各组分的浓度分别为STX0.97mg/L、NEO1.03mg/L、GTX11.24mg/L、GTX22.26mg/L、GTX30.86mg/L、GTX40.41mg/L、dcGTX22.05mg/L、dcGTX30.46mg/L、C12.70mg/L和C20.83mg/L的混合标准储备液；临用时用0.1mol/LHAC稀释成一定浓度系列的混合标准溶液；（2）样品溶液的制备：准确称取0.01-1.00g赤潮藻藻体置于5-100mL离心管中，加入2-50mL0.1mol/L提取溶剂，首先采用超声细胞粉碎仪破碎1-30min，再超声波辅助提取1-60min，然后以2000-12000r/min的转速将藻体与提取液离心分离，吸取1mL上清液经0.22μm滤膜过滤，注入样品瓶中，备用；（3）亲水作用色谱-电喷雾质谱条件：WatersAtlantisHILICSilica色谱柱，流动相A为水，B为95%乙腈，流速为0.4mL/min，进样量5μL，室温20-25℃，梯度洗脱；（4）电喷雾飞行时间质谱条件:分别采用正离子和负离子模式全扫描Scan检测，全扫描质荷比m/z范围为100~500；干燥气温度：350℃，干燥气流速：10L/min,喷雾气压：241.3kPa，毛细管电压：4500V，裂解电压：120V，锥孔电压：60V；（5）麻痹性贝毒素精确相对分子质量数据库的建立：建立赤潮藻所产生的常见麻痹性贝毒素相关信息库，包括毒素化合物分子式、正负模式准分子离子峰理论精确质量数以及主要碎片峰和元素组成；（6）赤潮藻中痹性贝毒素精确质量数快速筛查及鉴别：通过精确相对分子质量对HILIC-ESI-TOF/MS分析赤潮藻痹性贝毒素粗提物得到的总离子流图进行各化合物信号提取，以实现赤潮藻提取物中各种麻痹性贝毒素的快速筛选；采用高分辨质谱自带的分子式计算软件对筛查到的毒素化合物分子式进行推断，还采用软件的同位素匹配功能，对测得的准分子离子峰的同位素峰进行匹配，以保证对于筛查到的痹性贝毒素鉴别结果的可靠性。步骤（3）中，流动相A水、B95%乙腈中优选含有5mM甲酸铵和0.1%甲酸。对于赤潮藻中痹性贝毒素的提取研究较多，由于痹性贝毒素为一类弱碱性化合物易溶于稀酸溶液，因此，文献中多采用稀酸溶液作为提取溶剂；在文献基础上，本专利技术优选以0.1mol/LHAc为提取溶剂，采用超声波细胞破碎法并超声波辅助提取法对产毒藻体进行处理，该法具有操作简便、快速、毒素提取率高等优点，能满足赤潮藻痹性贝毒素快速筛选分析的检测要求。可以用于海洋环境管理部门快速确定赤潮藻中是否含有麻痹性贝毒素，进一步判断海区贝类毒素对水产品影响，保障水产品消费安全。附图说明图1为10种痹性贝毒素混合标准品HILIC-ESI-TOF/MS总离子流和提取离子图；图2为产毒藻中GTX2和GTX3提取离子图；图3产毒藻中GTX2峰的质谱图。具体实施方式以下参照附图，进一步描述本专利技术的具体技术方案，以便于本领域的技术人员进一步地理解本专利技术，而不构成对其权利的限制。实施例1，一种快速筛查鉴别赤潮藻中多种麻痹性贝毒素的方法，其步骤如下：（1）称取适量的赤潮藻藻体样品，置于离心管中，加入适量的提取溶剂，采用细胞粉碎仪或藻体研磨法破碎，再进行若干麻痹性贝毒素提取，合并提取液；合并液离心分离除去沉淀，吸取上清液经微孔滤膜过滤，注入样品瓶中，备用；（2）采用高效液相色谱-高分辨率质谱法对赤潮藻粗提液中的痹性贝毒素进行分离分析。（3）通过与赤潮藻常见麻痹性贝毒素精确分子质量相关信息比对：相关信息包括毒素化合物分子式、正负模式准分子离子峰理论精确质量数以及主要碎片峰和元素组本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种快速筛查鉴别赤潮藻中多种麻痹性贝毒素的方法，其特征在于，其步骤如下：（1）称取适量的赤潮藻藻体样品，置于离心管中，加入适量的提取溶剂，采用细胞粉碎仪或藻体研磨法破碎，再进行若干麻痹性贝毒素提取，合并提取液；合并液离心分离除去沉淀，吸取上清液经微孔滤膜过滤，粗提液注入样品瓶中，备用；（2）采用高效液相色谱‑高分辨率质谱法对赤潮藻粗提液中的痹性贝毒素进行分离分析；（3）通过与赤潮藻常见麻痹性贝毒素精确分子质量相关信息比对：相关信息包括毒素化合物分子式、正负模式准分子离子峰理论精确质量数以及主要碎片峰和元素组成，实现赤潮藻中多种常见麻痹性贝毒素的快速鉴别。

【技术特征摘要】
1.一种快速筛查鉴别赤潮藻中多种麻痹性贝毒素的方法，其特征在于，其步骤如下：（1）称取适量的赤潮藻藻体样品，置于离心管中，加入适量的提取溶剂，采用细胞粉碎仪或藻体研磨法破碎，再进行若干麻痹性贝毒素提取，合并提取液；合并液离心分离除去沉淀，吸取上清液经微孔滤膜过滤，粗提液注入样品瓶中，备用；（2）采用高效液相色谱-高分辨率质谱法对赤潮藻粗提液中的痹性贝毒素进行分离分析；（3）通过与赤潮藻常见麻痹性贝毒素精确分子质量相关信息比对：相关信息包括毒素化合物分子式、正负模式准分子离子峰理论精确质量数以及主要碎片峰和元素组成，实现赤潮藻中多种常见麻痹性贝毒素的快速鉴别。2.根据权利要求1所述的一种快速筛查鉴别赤潮藻中多种麻痹性贝毒素的方法，其特征在于，所述的赤潮藻藻体中痹性贝毒素提取方法包括：回流提取法、微波提取法、超声提取法、微波-回流提取法、超声-回流提取法。3.根据权利要求1所述的一种快速筛查鉴别赤潮藻中多种麻痹性贝毒素的方法，其特征在于，所述高效液相色谱-高分辨率质谱法中的色谱分离方法包括：反相高效液相色谱法、亲水作用色谱法、离子色谱法、排阻色谱法；采用的高分辨质谱法包括飞行时间质谱法、静电场轨道阱质谱法、傅里叶变换质谱、磁质谱。4.根据权利要求1所述的一种快速筛查鉴别赤潮藻中多种麻痹性贝毒素的方法，其特征在于，其具体步骤如下：（1）对照品溶液的配制：选择麻痹性贝毒素标准溶液包括：CRM-STX-e、CRM-NEO-b、CRM-GTX1＆4-c、CRM-GTX2＆3-c、CRM-dcGTX2＆3-c、CRM-C1＆2；将痹性贝毒素标准溶液用0.1mol/LHAC稀释成各组分的浓度分别为STX0.97mg/L、NEO1.03mg/L、GTX11.24mg/L、GTX22.26mg/L、GTX30.86mg/L、GTX40.41mg/L、dcGTX22.05mg/L、dcGTX30.46mg/L、C12.7...

【专利技术属性】
技术研发人员：宋新成，周德山，尹华斌，邵帅，宋向明，
申请(专利权)人：连云港市海洋环境监测预报中心，
类型：发明
国别省市：江苏,32