检测人血浆中阿托伐他汀及代谢物的液相色谱‑串联质谱方法及临床药动学研究的应用技术

本发明专利技术涉及阿托伐他汀及代谢物的液相色谱‑串联质谱方法及临床药动学研究的应用。本发明专利技术提供了检测血浆中阿托伐他汀及代谢物浓度的方法，通过LC‑MS/MS对血浆中阿托伐他汀及代谢物浓度进行分析。本发明专利技术方法优选采用盐析辅助液‑液提取的蛋白沉淀预处理方法，以氘代阿托伐他汀及代谢物为内标，采用采用Kinetex XB C18柱洗脱，电喷雾电离源(ESI)串联质谱检测。使本发明专利技术方法的血浆样本提取回收率大于80％，未受基质效应影响，其专一性选择性强、灵敏度高、检测快速、用量小，满足简单、可靠、高通量、条件可控的临床大批量样品分析需求。本发明专利技术方法的特异性、稳定性等均进行了验证，已成功用于评价阿托伐他汀及其代谢物各剂型的生物等效性。

【技术实现步骤摘要】
检测人血浆中阿托伐他汀及代谢物的液相色谱-串联质谱方法及临床药动学研究的应用
本专利技术属于生物医药
，尤其涉及检测人血浆中阿托伐他汀及代谢物的液相色谱-串联质谱方法及其应用。
技术介绍
阿托伐他汀(Atorvastatin，AT)结构式如图1、图2、图3所示，是羟甲戊二酰辅酶A选择性抑制剂，可以有效降低血脂水平。AT在人体内主要由细胞色素P450酶代谢为邻羟基阿托伐他汀(ortho-hydroxyatorvastatin，o-OAT)和对羟基阿托伐他汀(para-hydroxyatorvastatin，p-OAT)。o-OAT和p-OAT占总体抑制活性的70％。同其他他汀类化合物一样，AT、o-OAT和p-OAT结构中含有羟基羧酸结构，无论在体内和体外均能脱水关环形成内酯，并且，该体内内酯代谢物在体外也易于水解转化为羟基羧酸，因而，羟基羧酸浓度测定易受影响不准确。现有技术测定阿托伐他汀及其代谢物，对准确度和灵敏度均有要求。为了减弱上述羟基羧酸结构与内酯间相互转化，一般需要在生物分析各个步骤控制温度和pH值，且样品预处理步骤越少，越有利于防止羟基羧酸型代谢物和内酯型代谢物相互转化。由于阿托伐他汀钙人体常用剂量较低，一般仅10mg。服药后血浆中阿托伐他汀的浓度很低，药物达峰浓度为10ng/mL左右。其活性代谢物p-OAT浓度更小，通常低于1ng/mL。因此，为了同时监测阿托伐他汀及其代谢物浓度，对检测方法的灵敏度要求很高。目前，提取血浆中药物的方法主要有蛋白沉淀法、液-液提取法和固相萃取法。蛋白沉淀预处理法操作较简单，也已有报道将蛋白沉淀预处理用于测定AT及其代谢物。但实际操作过程中，蛋白沉淀提取后的样品中含有内源性基质，容易造成基质效应等问题。当仪器检测的灵敏度无法达到研究目的时，常常需要浓缩大量血浆，因为往往引入更多的基质。为防止基质在色谱柱上蓄积，一般采用长时间梯度洗脱来避免基质蓄积，这无疑极大地降低了分析通量。鉴于蛋白沉淀法的以上缺点，已报道的测定阿托伐他汀及其代谢物方法中，样品预处理方法多为液-液提取法和固相萃取法。然而两种方法的预处理步骤比较繁琐、费时、温度和pH不易控制，易导致阿托伐他汀及其代谢物的测定结果不准确。由于上述不足，出现了盐析辅助液-液提取方法，该法操作简单、成本低、样品纯净，近年来受到广泛关注。盐析是一种结晶蛋白的常用方法。基于电解质-非电解质相互作用理论。当电解质浓度升高时，非电解质在水溶液中的溶解度降低。在水溶液中增加电解质的浓度即可降低亲脂性物质在水中的溶解度，将待测物提取到有机试剂层中，与水溶性内源基质分离。但该法普遍存在灵敏度低和血浆用量大的缺点。现有血浆药物浓度的仪器检测方法有液相色谱-紫外法、液相色谱串联质谱法等。液相色谱-紫外法是药物浓度检测的金标准，但该检测技术具有选择性差、灵敏度低等特点，限制了该技术在生物样品检测领域的应用。液相色谱-串联质谱技术，兼容了色谱的分离能力与质谱的高选择性，已经成为生物分析领域的最重要的工具。尽管液相色谱-串联质谱技术极大地增强了定量分析能力，但该技术也同样存在一些缺点，面临着一些挑战。如质谱中待测物离子化的过程常被样品中的生物基质所影响，导致响应的波动，影响测定的准确性。相关报道如下：Zhou于2013年建立了液-液提取联合液相色谱-串联质谱法测定血浆中AT、o-OAT和p-OAT。该方法灵敏度较高，可达20pg/mL左右，但血浆用量较大，为0.5毫升。液-液提取的方法，步骤复杂且不能有效控制提取体系的pH值，也没有对内酯和羟基羧酸之间的相互转化做有效的评估。色谱运行时间较长，需要约6分钟，不适合大批量样品测试。Liu于2008年建立固相萃取-联合液相色谱-串联质谱法测定血浆中AT、p-OAT的分析方法。尽管色谱运行短，仅为2.5min。血浆用量少，仅0.1毫升。但分析方法的灵敏度不足，p-OAT的定量下限仅为0.2ng/mL，无法完整的检测其药动学特征，且该分析方法不能检测o-OAT。同时，固相萃取法步骤复杂、耗时长，同样不适合大批量样品检测。Hassan于2014建立了SALLE联合液相色谱法测定人血浆中AT。方法中使用了氯化镁作为盐析试剂。该氯化镁为不挥发性盐，不适合质谱检测。该分析方法使用紫外检测器，选择性差，方法的灵敏度很低为1.00ng/mL，并且提取方法使用了1毫升血浆样品，血浆消耗量过大。灵敏度低和血浆用量大的特点使该方法不适合现有的临床研究。有鉴于上述的缺陷，为满足临床大批量样品分析的需求，需开发更简单、可靠、高通量的样品预处理方法及血浆药物浓度测定方法，用于测定阿托伐他汀及其代谢物。
技术实现思路
为解决上述技术问题，本专利技术的目的是提供一种解决血浆用量大、提取步骤复杂、提取条件不可控、灵敏度低、色谱运行时间长，无法同时高灵敏及低样品量检测等问题的液相色谱-串联质谱方法，用于检测阿托伐他汀及两种代谢物。本专利技术技术方案如下：检测人血浆中阿托伐他汀及代谢物的液相色谱-串联质谱方法，含下述步骤：预处理，取血浆，加入阿托伐他汀及代谢物同位素内标溶液，以6M醋酸铵水溶液和乙腈为盐析分层试剂沉淀蛋白，涡流及离心后制得血浆样品；色谱，将血浆样品液相色谱分离，采用KinetexXBC18柱，梯度洗脱，流动相A:流动相B初始体积比为60:40，流速0.8mL/min，柱温40℃，流动相A为水，流动相B为乙腈；质谱，电喷雾电离源，正离子多反应监测(+MRM)扫描，喷雾电压5500V，内源气体1(N2)65psi，气体2(N2)75psi，气帘气体(N2)35psi，离子源温度500℃，阿托伐他汀反应监测离子[M+H]+m/z559→m/z440，CE22eV，D5-阿托伐他汀反应监测离子[M+H]+m/z564→m/z445，CE22eV，邻羟基阿托伐他汀和对羟基阿托伐他汀反应监测离子[M+H]+m/z575→m/z440，CE34eV，D5-邻羟基阿托伐他汀和D5-对羟基阿托伐他汀反应监测离子[M+H]+m/z580→m/z445，CE34eV；计算，以阿托伐他汀及代谢物浓度为横坐标，阿托伐他汀及代谢物与阿托伐他汀及代谢物内标物的峰面积比为纵坐标，回归制得相应标准曲线方程，计算阿托伐他汀及代谢物的血药浓度。本专利技术方法进一步地，所述预处理步骤，采用冰冻醋酸铵水溶液和乙腈。本专利技术方法进一步地，所述预处理步骤，内标溶液配制：称取D5-阿托伐他汀、D5-邻羟基阿托伐他汀和D5-对羟基阿托伐他汀，以甲醇溶解并定容制得1.00mg/mL的内标贮备液，吸取各内标贮备液适量，加入稀释液得浓度10.0ng/mL的D5-阿托伐他汀、D5-邻羟基阿托伐他汀和D5-对羟基阿托伐他汀的内标溶液，所述稀释液为甲醇和水混合液，甲醇:水的体积比为50:50。本专利技术方法进一步地，所述预处理步骤，取100μL血浆，分别加入20.0μL内标溶液、100μL6M醋酸铵水溶液和400μL乙腈，涡流及离心后取上清液于氮气流吹干浓缩，残留物以乙腈和水溶解且涡流混匀得血浆样品，乙腈:水的体积比为40:60。本专利技术方法更进一步地，经所述涡流提取血浆样品的时间控不超过1min。本专利技术方法更进一步地，所述涡流及离心条件为涡流1min，14000rpm离心1min。本本文档来自技高网...

【技术保护点】
检测人血浆中阿托伐他汀及代谢物的液相色谱‑串联质谱方法，其特征在于包括下述步骤：预处理，取血浆，加入阿托伐他汀及代谢物同位素内标溶液，以6M醋酸铵水溶液和乙腈为盐析分层试剂沉淀蛋白，涡流及离心后制得血浆样品；色谱，将血浆样品液相色谱分离，采用Kinetex XB C18柱，梯度洗脱，流动相A:流动相B初始体积比为60:40，流速0.8mL/min，柱温40℃，流动相A为水，流动相B为乙腈；质谱，电喷雾电离源，正离子多反应监测(+MRM)扫描，喷雾电压5500V，内源气体1(N2)65psi，气体2(N2)75psi，气帘气体(N2)35psi，离子源温度500℃，阿托伐他汀反应监测离子[M+H]+m/z 559→m/z 440，CE 22eV，D5‑阿托伐他汀反应监测离子[M+H]+m/z 564→m/z 445，CE 22eV，邻羟基阿托伐他汀和对羟基阿托伐他汀反应监测离子[M+H]+m/z 575→m/z 440，CE34eV，D5‑邻羟基阿托伐他汀和D5‑对羟基阿托伐他汀反应监测离子[M+H]+m/z580→m/z 445，CE 34eV；计算，以阿托伐他汀及代谢物浓度为横坐标，阿托伐他汀及代谢物与阿托伐他汀及代谢物内标物的峰面积比为纵坐标，回归制得相应标准曲线方程，计算阿托伐他汀及代谢物的血药浓度。...

【技术特征摘要】
1.检测人血浆中阿托伐他汀及代谢物的液相色谱-串联质谱方法，其特征在于包括下述步骤：预处理，取血浆，加入阿托伐他汀及代谢物同位素内标溶液，以6M醋酸铵水溶液和乙腈为盐析分层试剂沉淀蛋白，涡流及离心后制得血浆样品；色谱，将血浆样品液相色谱分离，采用KinetexXBC18柱，梯度洗脱，流动相A:流动相B初始体积比为60:40，流速0.8mL/min，柱温40℃，流动相A为水，流动相B为乙腈；质谱，电喷雾电离源，正离子多反应监测(+MRM)扫描，喷雾电压5500V，内源气体1(N2)65psi，气体2(N2)75psi，气帘气体(N2)35psi，离子源温度500℃，阿托伐他汀反应监测离子[M+H]+m/z559→m/z440，CE22eV，D5-阿托伐他汀反应监测离子[M+H]+m/z564→m/z445，CE22eV，邻羟基阿托伐他汀和对羟基阿托伐他汀反应监测离子[M+H]+m/z575→m/z440，CE34eV，D5-邻羟基阿托伐他汀和D5-对羟基阿托伐他汀反应监测离子[M+H]+m/z580→m/z445，CE34eV；计算，以阿托伐他汀及代谢物浓度为横坐标，阿托伐他汀及代谢物与阿托伐他汀及代谢物内标物的峰面积比为纵坐标，回归制得相应标准曲线方程，计算阿托伐他汀及代谢物的血药浓度。2.根据权利要求1所述的检测人血浆中阿托伐他汀及代谢物的液相色谱-串联质谱方法，其特征在于：所述预处理步骤，采用冰冻醋酸铵水溶液和乙腈。3.根据权利要求1所述的检测人血浆中阿托伐他汀及代谢物的液相色谱-串联质谱方法，其特征在于：所述预处理步骤，内标溶液配制：称取D5-阿托伐他汀、D5-邻羟基阿托伐他汀和D5-对羟基阿托伐他汀，以甲醇溶解并定容制得1.00mg/mL的内标贮...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨勇，钟勘，陈云辉，钮小英，刘旭凌，
申请(专利权)人：苏州海科医药技术有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32