本发明专利技术公开了新型抗病毒蛋白C19orf66在制备抗寨卡病毒药物中的应用，所述新型抗病毒蛋白C19orf66通过干扰素刺激及寨卡病毒感染，能有效刺激其表达水平上升，同时稳定高表达的C19orf66可以特异性地抑制寨卡病毒的感染，同时，本发明专利技术还发现，沉默内源性C19orf66可促进寨卡病毒的感染。本发明专利技术证明了C19orf66具有高效的抗寨卡病毒感染和增殖的活性，为抗寨卡病毒的药物开发提供新的思路及方向。
Application of novel antiviral protein C19orf66 in preparation of anti blocking virus medicine
The application of the invention discloses a novel antiviral protein C19orf66 in preparing anti Zika virus drugs, the new antiviral protein of C19orf66 virus infection with interferon stimulation and Zhai card, can effectively stimulate the expression level increased, and stable high expression of C19orf66 can specifically inhibit Zika virus infection, at the same time, the invention also found that silencing of endogenous C19orf66 can promote Zika virus infection. The present invention proves that C19orf66 has high activity against infection and proliferation of walled virus, and provides a new idea and direction for the development of the anti blocking virus drug.
【技术实现步骤摘要】
新型抗病毒蛋白C19orf66在制备抗寨卡病毒药物中的应用
本专利技术属于蛋白质工程
，更具体地，涉及新型抗病毒蛋白C19orf66在制备抗寨卡病毒药物中的应用。
技术介绍
寨卡病毒属于黄病毒科(Flaviviridae)黄病毒属(Flavivirus)，病毒颗粒呈球状，直径约为40～70nm。寨卡病毒为单股正链RNA病毒，基因组长约10.8kb，含一条单一开放读码框，病毒蛋白由一个单一的多蛋白前体，经宿主蛋白酶和病毒蛋白酶切而成，包括3个结构蛋白(C、prM/M、E)和7个非结构蛋白(NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B、NS5)，结构蛋白位于氨基端，非结构蛋白位于羧基端，具有丝氨酸蛋白酶、RNA解旋酶和RNA依赖RNA聚合酶(RdRP)功能。其中，衣壳蛋白和单股正链RNA基因组构成20面体对称的核衣壳，外层脂质包膜。黄病毒科病毒基因组RNA具有mRNA，复制模板RNA和遗传物质RNA三种作用，病毒大多通过受体介导的内吞作用进入细胞，在低pH值环境下病毒包膜与细胞膜融合，释放病毒核酸。RNA复制在细胞质内进行，合成全长负链RNA，形成中间体，子代病毒出芽到细胞内膜结构(ER)中，然后通过宿主细胞分泌通路，最终转运至包膜，成熟释放。分子生物学和生物信息学分析表明，寨卡病毒目前主要存在非洲型和亚洲型两个亚型，在系统发生树上与同为黄病毒属的登革病毒、日本脑炎病毒及西尼罗病毒相近。寨卡病毒主要通过病毒感染的伊蚊类蚊媒叮咬传播，与登革病毒及基孔肯雅病毒传播方式相似，埃及伊蚊(Aedesaegypti)为主要传播媒介。寨卡病毒还可通过母婴、血液和性接触传播，以患者、隐性感染者和感染寨卡病毒的非人类灵长动物作为传染源。包括孕妇在内的各类人群对寨卡病毒普遍易感。寨卡病毒于1947年首次在乌干达被发现，科学家们在用于黄热病监测的恒河猴体内分离到一种病毒，命名为“寨卡病毒”。1952年，乌干达及坦桑尼亚发现人感染寨卡病毒，随后仅有该病的零星报告或小规模流行。直至2007年，位于南太平洋地区密克罗尼西亚(Micronesia)联邦雅浦(Yap)岛发生寨卡病毒暴发流行，病毒由东南亚输入，也是首次发现寨卡病毒在亚非大陆以外传播。2013年，法属波利尼西亚发生寨卡病毒暴发。2015年以前，暴发疫情主要分布在非洲、东南亚和太平洋岛国。2015年5月，巴西发现首例确诊寨卡病例，泛美卫生组织(PAHO)发出警告，巴西政府估计有44～150万人感染寨卡病毒。随后，美洲多个国家相继发生寨卡病毒感染病例。迄今，全世界已有30多个国家报道寨卡病毒感染并引发多个国家输入性病例。截止2016年9月12日，中国大陆已发现16例输入性寨卡病毒病病例。寨卡病毒病流行范围不断扩大，已成为国际社会关注的焦点，WHO于2016年2月1日针对寨卡病毒召开紧急委员会会议，并宣布寨卡病毒的扩散已构成“全球关注的紧急公共卫生事件”。寨卡病毒典型的临床表现为急性发热伴斑丘疹、关节痛或结膜炎。其他常见的症状可包括肌痛和头痛。但是，有病例在寨卡病毒感染后出现格林-巴利综合征(Guillain-Barré综合征)及自身免疫病症状。同时，在巴西，卫生部门发现寨卡病毒感染与小头畸形患儿增加有关。根据世界卫生组织的报道，2015年巴西的寨卡暴发流行中发现了很多小头畸形的新生儿(出生的新生儿头围与匹配的相同性别和孕龄的孩子比，低于平均值超过了两个标准差)。对寨卡疫情开展调查发现，越来越多的证据表明寨卡病毒与小头症之间存有关联。目前，尚无特异性的寨卡疫苗及抗病毒药物上市，因此，开发具有寨卡病毒特异性的实验室诊断检测工具以解决有效的疫苗和特异性治疗药物的研制工作已成为当前的关键科学问题及重大需求。干扰素(interferon,IFN)，是由英国科学家Isaacs于1957年利用鸡胚绒毛尿囊膜研究流感病毒干扰现象时首先发现的。IFN是一种广谱抗病毒剂，并不直接杀伤或抑制病毒，而主要是通过细胞表面受体作用使细胞产生抗病毒蛋白，从而抑制病毒的复制，同时还可增强自然杀伤细胞(NK细胞)、巨噬细胞和T淋巴细胞的活力，从而起到免疫调节作用，并增强抗病毒能力。是目前最主要的抗病毒感染的生物制品。最近的研究表明，C19orf66具有拮抗登革病毒复制的功能，可能通过与登革病毒RNA及细胞mRNA结合蛋白相互作用而干扰登革病毒的翻译。目前尚无研究证明C19orf66具有抗寨卡病毒感染的功能。
技术实现思路
本专利技术的目的在于根据现有技术中的不足，提供了新型抗病毒蛋白C19orf66在制备抗寨卡病毒药物中的应用。本专利技术的目的通过以下技术方案实现：本专利技术提供了抗病毒蛋白C19orf66在制备抗寨卡病毒药物中的应用。进一步地，上述抗病毒蛋白C19orf66是在制备抑制寨卡病毒在宿主细胞增殖的药物中的应用。进一步地，所述抗病毒蛋白C19orf66是在制备抗寨卡病毒感染药物中的应用。I型及III型干扰素刺激人肝癌细胞系(Huh7)基因动态表达分析中，在IFN-α及IFN-β的刺激下，C19orf66的RNA表达量上升，提示其为可能的ISG。C19orf66位于19号染色体短臂1区3带2亚带，cDNA全长768bp，有两种转录剪接体，表达的蛋白产物含有255位氨基酸残基。本研究通过探索新型抗病毒蛋白C19orf66，是否可以特异性地抑制寨卡病毒复制，为抗寨卡病毒药物的开发提供科学依据，并为临床抗病毒治疗提供新思路。具体验证过程包括：1、分别采用I型干扰素IFN-α和IFN-β刺激A549细胞，鉴定细胞内源性C19orf66表达水平：2、构建高表达pMSCV-C19orf66重组质粒，并鉴定外源性C19orf66的细胞株蛋白表达水平；3、采用寨卡病毒GZ01株感染高表达C19orf66的A549细胞株，鉴定C19orf66抗寨卡病毒活性；4、采用基因沉默技术，鉴定沉默内源性C19orf66的活性。与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：本专利技术所提供的新型抗病毒蛋白C19orf66蛋白，能高效地抑制寨卡病毒株在宿主细胞中的增殖。这开拓了人源化抗病毒蛋白在抗病毒防治领域的临床应用新领域，从而为抗寨卡病毒的药物开发提供新的思路及方向。附图说明图1是RealtimeRT‐PCR方法检测IFN‐α、IFN‐β刺激A549细胞后，0.5h，1h，3h，6h，24h，48h各时间点C19orf66mRNA表达变化的结果图。图2是寨卡病毒GZ01株感染A549细胞0h，3h，6h，12h，24h，48h各时间点细胞裂解液中内源性C19orf66mRNA表达变化的结果。图3是稳定高表达C19orf66的A549细胞裂解液中C19orf66蛋白表达变化的Westernblotting鉴定结果图。图4是实时荧光定量RT‐PCR检测寨卡病毒GZ01株感染高表达C19orf66的A549细胞后，A549细胞内及上清中的寨卡病毒RNA结果图。图5是沉默内源性C19orf66的Huh7细胞裂解液中，C19orf66蛋白表达变化的Westernblotting鉴定结果图。图6是实时荧光定量RT‐PCR检测寨卡病毒GZ01株感染沉默内源性C19orf66的Huh7细胞后，胞内及上清中的寨卡病毒RNA结果图。具体实施方式以下本文档来自技高网...
【技术保护点】
抗病毒蛋白C19orf66在制备抗寨卡病毒药物中的应用。
【技术特征摘要】
1.抗病毒蛋白C19orf66在制备抗寨卡病毒药物中的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述抗病毒蛋白C19orf66是在制备抑制...
【专利技术属性】
技术研发人员：黎孟枫，朱勋，何振健，吴珏珩，林嘉捷，章诗豪，胡忆文，陈嘉慧，安树，董信怀，于暕辰，袁洁，李隽，朱显忠，古锦敏，杨毅，
申请(专利权)人：中山大学，
类型：发明
国别省市：广东,44
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