一种基于焦磷酸测序检测双位点SNP的方法技术

本发明专利技术公开了一种基于焦磷酸测序检测双位点SNP的方法，该方法基于SNP位点之间的差异，设计对应的引物进行扩增后进行检测，可同时对两个SNP位点进行焦磷酸测序。本发明专利技术提供的基于焦磷酸测序检测双位点SNP的方法可以同时检测两个SNP位点，随机成功率高，节约了一倍的人力物力，且结果可视化、准确率高，降低了检测成本，满足了临床上双位点同时检测的需要，也为未来多位点的焦磷酸测序检测SNP检测奠定了理论基础，具有良好的推广价值。

A method for detecting double site SNP based on pyrosequencing

The invention discloses a method for pyrosequencing double sites based on SNP, this method is based on the difference of SNP between loci, primers were designed corresponding amplification were detected after simultaneous pyrosequencing of two SNP loci. The invention provides a method for pyrosequencing double sites based on SNP can simultaneously detect two SNP loci randomly, high success rate, saving a doubling of manpower and material resources, and results visualization, high accuracy, reduces the detection cost, and meet the needs of clinical test of double locus, but also laid the theoretical the foundation for pyrosequencing SNP future multilocus detection, and has good popularization value.

【技术实现步骤摘要】
一种基于焦磷酸测序检测双位点SNP的方法
本专利技术涉及一种基于焦磷酸测序检测双位点SNP的方法，属于单核苷酸多态性检测领域。
技术介绍
单核苷酸的多态性(singlenucleotidepolymorphism，SNP)是最为常见的一种遗传多态性，占所有已知多态性的的90％以上。现有公共数据库中已经报道了超过900万个SNP位点。开展SNP研究对遗传学、医学、药物开发与合理用药、临床诊断、法医学的发展均具有十分重要的意义。作为第三代遗传标记，SNP具有稳定遗传、高密度、容易规模化和自动化分析等前两代遗传标记无可比拟的优点。SNP分型检测工作，已成为当前国际上研究的热点。近年来，SNP检测方法和相关仪器的研发进展很快。目前，进行SNP分型检测的基本方法已达20余种。各种SNP分型检测方法可看成由等位基因特异性识别的原理方法和等位基因识别产物的分析检测两部分组成。等位基因特异性识别原理有引物延伸反应原理、序列杂交反应原理、酶连接反应原理、酶切割反应原理等；等位基因分析检测手段有质谱、荧光共振和偏振信号检测、化学发光检测、生物传感器检测等。为了提高方法的特异性和灵敏度，绝大多数的基因分型方法都需要对目标检测序列片段进行PCR扩增从而增加检测靶标分子的数目。等位基因识别反应在溶液中更为稳定，但在固相载体上捕获反应产物能够使大量检测平行进行，从而极大提高分析的通量。虽然两个部分操作可以在一定的条件下同时进行，但是为了提高检测的精确性和灵敏度，大多数的分型方法都将两个操作过程分离进行。焦磷酸测序(preosequencing)技术是近年来发展起来的一种新的DNA序列分析技术，它通过核苷酸和模板结合后释放的焦磷酸引发酶级联反应，促使荧光素发光并进行检测。是一个理想的遗传分析技术平台，既可进行DNA序列分析，又可进行基于序列分析的单核苷酸多态性(SNP)检测及等位基因频率测定等，该项技术目前已被广泛应用于医学生物等各个领域。焦磷酸测序是由DNA聚合酶(DNApolymerase)、三磷酸腺苷硫酸化酶(ATPsulfurylase)、荧光素酶(luciferase)和双磷酸酶(apyrase)4种酶催化同一反应体系的酶级联化学发光反应，反应底物为5’-磷酰硫酸(adenosine5’phosphosulfate，APS)和荧光素。反应体系还包括待测序DNA单链和测序引物。在每一轮测序反应中，加入1种dNTP，若该dNTP与模板配对，聚合酶就可以将其掺入到引物链中并释放出等摩尔数的焦磷酸基团(PPi)。硫酸化酶催化ASP和PPi形成ATP，后者驱动荧光素酶介导的荧光素向氧化荧光素的转化，发出与ATP量成正比的可见光信号，并由PyrogramTM转化为一个峰值，其高度与反应中掺入的核苷酸数目成正比。根据加入dNTP类型和荧光信号强度就可实时记录模板DNA的核苷酸序列。在实验过程中用α-硫化的三磷酸腺苷(dATPαS)代替三磷酸腺苷(dATP)以有效地被DNA聚合酶利用，而不被虫荧光素识别。由于SpdATPαS可以降低dATPαS降解产物的浓度，近年来，单链DNA结合蛋白(singlestarndDNAbindingportein，SSBP)和纯化SpisomerdATPaS的使用dATPαS降解产物抑制双磷酸酶活性的这一问题得到较好解决，使得测序长度可达10bp，拓展了该技术在遗传学领域的应用范围。由于单核苷酸位点多，一段表达蛋白的基因上可能存在多个SNP位点，但由于现有的SNP位点检测手段的限制，SNP位点检测均为单一检测，即各位点需要单独扩增后进行测序，无法在一个体系中对多个SNP位点同时进行检测。中国专利CN10249166B公开了一种利用人工熔点标签序列对待测SNP进行标记，实现了在一个单管中检测多个SNP位点，该方法采用荧光探针或熔点的差异来区分各SNP位点的基因型。该方法虽然可以实现在同一反应体系中检测多个SNP位点，但该方法制备样品复杂，制备过程繁琐，对反应温度的要求非常高，检测结果对反应体系的依赖度过高，检测所需仪器及试剂昂贵，提高了使用者的经济负担，不适合大规模推广使用。
技术实现思路
针对现有技术存在的上述问题，本专利技术的目的是提供一种利用焦磷酸测序的方法实现在同一检测体系中检测两个SNP位点的方法。为实现上述专利技术目的，本专利技术采用的技术方案如下：一种基于焦磷酸测序检测双位点SNP的方法，具体包括以下步骤：a、将待检测DNA序列进行扩增、分离，其中待检测DNA序列为稳定的DNA单链；b、将分离后的待测DNA单链样品加入反应体系，且同时加入双位点SNP对应的引物，经所述引物启动互补链扩增，且分别经焦磷酸测序检测与待测DNA单链互补碱基序列以确定待测SNP位点；其中，所述对应不同位点的引物对应同一待测DNA序列的两个待测SNP位点的扩增起始端至SNP位点的碱基序列至少有n碱基不同或距SNP位点的距离不同，n≥1。为了保证测序工作的正常进行，待测DNA序列需为稳定的DNA单链，不能稳定维持单链状态的DNA，如会配对形成发夹结构的DNA序列，链内自配对或待测链之间配对的DNA序列无法采用本专利技术中的检测方法进行测序。作为一种优选的实施方式，对应不同位点的引物对应同一待测DNA序列的两个待测SNP位点的扩增起始端至SNP位点的碱基序列至少有1个或2个碱基不同或距SNP位点的距离不同。至少1个碱基的不同可以保证最后的检测结果中对两个SNP位点进行区分，换言之，检测基于碱基之间的种类及位置差异对待测SNP位点进行区分，理论上1个碱基的差异即可实现，2个或2个以上碱基的不同可起到保证结果准确性的作用。当两段检测片段中自检测起始位点至SNP位点的碱基的种类及排列方式均一样时，需通过不同的检测起始点来对两段SNP片段进行区分，起始点的选择方式在此不做赘述，可以实现本专利技术中双位点检测的选择方式均认为是可行的。优选地，扩增起始位点为两个SNP位点的5’端，或两个SNP位点的3’端，或一个SNP位点的5’端与另一个SNP位点的3’端。两段SNP位点在检测中的检测方向并不需要完全一致，只要被检测的序列之间有差异可以进行本专利技术中的双位点检测即可。优选地，SNP位点为SNP位点或SNP位点互补链的配对碱基。SNP位点根据其特征及不同位点之间的差异，位点本身的变化情况是已知的，换言之，检测结果的范围是已知的，本专利技术中的双位点SNP检测方法是基于单个SNP位点检测的效率低消耗大出发，根据SNP位点之间的差异进行设计检测，任何可以帮助实现双位点检测的设计方式均认为是可行的，包括上述的改变检测起始点、选择不同检测方向等，另一种优选的实施方式是可以选择SNP位点互补链进行检测，通过互补链的结果可以逆向得出SNP位点结果。当SNP位点的两条链碱基均发生突变的极端情况时，检测方式不限，对两条链均进行SNP检测也是可行的。优选地，同一体系中的两个SNP位点为同一段基因上的两个SNP位点。优选地，同一体系中的两个SNP位点为两段基因上的单个SNP位点。对于SNP位点的来源本专利技术不做限制，待测SNP位点可以为同一段基因上的双位点SNP，也可以是不同DNA片段的基因。当SNP位点的数量大于两个时，本专利技术中的检测方法在可以设计出检测探针的情况下，仍可以进行本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于焦磷酸测序检测双位点SNP的方法，其特征在于，具体包括以下步骤：a、将待检测DNA序列进行扩增、分离，其中待检测DNA序列为稳定的DNA单链；b、将分离后的待测DNA单链样品加入反应体系，且同时加入双位点SNP对应的引物，经所述引物启动互补链扩增，且分别经焦磷酸测序检测与待测DNA单链互补碱基序列以确定待测SNP位点；其中，所述对应不同位点的引物对应同一待测DNA序列的两个待测SNP位点的扩增起始端至SNP位点的碱基序列至少有n碱基不同或距SNP位点的距离不同，n≥1。

【技术特征摘要】
2017.01.12 CN 2017100222087;2017.02.01 CN 201710061.一种基于焦磷酸测序检测双位点SNP的方法，其特征在于，具体包括以下步骤：a、将待检测DNA序列进行扩增、分离，其中待检测DNA序列为稳定的DNA单链；b、将分离后的待测DNA单链样品加入反应体系，且同时加入双位点SNP对应的引物，经所述引物启动互补链扩增，且分别经焦磷酸测序检测与待测DNA单链互补碱基序列以确定待测SNP位点；其中，所述对应不同位点的引物对应同一待测DNA序列的两个待测SNP位点的扩增起始端至SNP位点的碱基序列至少有n碱基不同或距SNP位点的距离不同，n≥1。2.根据权利要求1所述的基于焦磷酸测序检测双位点SNP的方...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘丹，孙悦，陈立波，
申请(专利权)人：武汉菲思特生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北,42