一种猪等孢球虫qRT‑PCR定量检测构建方法技术

本发明专利技术涉及生物基因工程技术领域，以引起仔猪腹泻的猪等孢球虫为研究对象，利用生物信息学及分子生物学技术扩增获得Is‑18S‑ITS1‑5.8S‑ITS2‑28S rRNA序列，筛选ITS2基因为目的基因，分别优化扩增引物(100nM)及探针浓度(100nM)，成功建立qRT‑PCR定量检测方法，通过敏感性及特异性检验，结果证实该方法可以特异性检测到样品中的单个卵囊，较传统检测方法：既可提高检测敏感性，又可做到定量分析的效果，因此该方法的建立将为猪球虫病爆发风险评估提供理论依据，对养猪业的发展具有重要意义。

The construction method of qRT spore Eimeria PCR quantitative detection of swine.

The present invention relates to the technical field of biological genetic engineering, in order to cause diarrhea of piglet Isospora suis as the research object, using bioinformatics and molecular biology of amplified Is 18S ITS1 5.8S ITS2 28S rRNA sequence, screening ITS2 gene were optimized primers and probe (100nM) concentration (100nM), the successful establishment of qRT for detection of PCR by quantitative, sensitivity and specificity of the test result proved that this method can detect specific single oocyst samples, compared with the traditional detection method can improve the detection sensitivity, but also can do quantitative analysis results, so this method for pigs coccidiosis outbreak risk assessment and provide a theoretical basis, has important significance for the development of pig industry.

【技术实现步骤摘要】
一种猪等孢球虫qRT-PCR定量检测构建方法
本专利技术涉及生物基因工程
，更具体的说，涉及一种猪等孢球虫qRT-PCR定量检测构建方法。
技术介绍
我国的母猪存栏量占全球50％以上，稳居全球第一位，是全球最大的养猪市场和猪肉消费市场，猪球虫病可引起仔猪严重腹泻甚至死亡，其仔猪发病率可高达50％，死亡率高达75％以上，严重危害养猪业发展，目前对该病的检测诊断主要为传统的镜检及普通PCR方法，误差较大，且不能精确定量分析，易造成猪球虫病发生的错误风险评估，因此建立新型的猪球虫病定量检测方法将为猪球虫病爆发风险评估提供理论依据，对养猪业的发展具有重要意义。猪等孢球虫病是引起仔猪严重腹泻甚至死亡的原虫病，目前对该病的检测主要为传统镜检及普通PCR方法，误差较大，且不能精确定量分析，易造成猪球虫病发生的错误风险评估。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题在于提供一种猪等孢球虫qRT-PCR定量检测构建方法，该方法利用在前期研究中克隆获得IS-ITS2序列，拟以猪等孢球虫为研究对象，建立实时荧光定量PCR(qRealTimePCR,qRT-PCR)检测方法，检测临床样品评价应用效果，预期结果为猪球虫病爆发风险评估提供理论依据。本专利技术所要解决的技术问题采用以下技术方案来实现。一种猪等孢球虫qRT-PCR定量检测构建方法，它包括：步骤一，构建Markergene-pMD18-T质粒：利用全长为3957bp的Is-HN18SrRNA-ITS1-5.8S-ITS2-28S基因序列，对基因序列进行生物信息学分析确定全长为433bp的ITS2基因序列为猪等孢球虫所特有的核糖体RNA基因序列，选择ITS2基因为Markergene，以前期所构建的Is-HN18SrRNA-ITS1-5.8S-ITS2-28S-pMD18-T质粒为模板，对Is-HNITS2基因进行PCR扩增，同时以ddH2O为模板作为阴性对照。配制50μLPCR反应体系(2×TaqPCRMasterMix:25μL；上游引物:5’-TGTCTCTGAAGTGTCAAGTTCTGTC-3’,下游引物:5’-TTAAGTTCAGCGGGTAATCTCG-3’各0.5μL，终浓度为1μM；质粒模板1μL；添加ddH2O至50μL)；反应条件为：94℃预变性5min，94℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸30sec，72℃延伸10min，35个循环，取PCR反应产物进行3％琼脂糖凝胶电泳，阳性产物经胶回收试剂盒纯化回收，产物连接至pMD18-T载体，再将连接产物转化入E.coliDH5α感受态细胞，挑取转化子进行菌落PCR鉴定，阳性菌进行测序，测序正确后提取质粒，并测定浓度保存待用。步骤二，筛选及优化qRT-PCR引物及探针：根据测序Is-ITS2基因序列，设计qRT-PCR引物及探针，摸索引物浓度，将引物分别稀释成终浓度为50nM、100nM、150nM、200nM和400nM，分别进行PCR扩增，PCR反应条件为：95℃30秒，以下共进行40循环(95℃15sec，60℃15sec，72℃30sec)，16℃终止反应。使用3％的琼脂糖电泳检测PCR产物；将探针分别稀释成终浓度为50nM、100nM、200nM和400nM，分别进行qRT-PCR，PCR反应条件为：Program1(预变性)：95℃30sec，1cycle；Program2(扩增程序)：95℃5sec，60℃20sec，40cycles。步骤三，建立标准曲线：根据质粒浓度10倍梯度稀释，分别稀释为100ng/μL、10ng/μL、1ng/μL、0.1ng/μL、0.01ng/μL及0.001ng/μL，按照步骤二qRT-PCR反应体系及程序分别进行qRT-PCR扩增，建立质粒标准曲线。步骤四，敏感性检验：对实验室所保存纯净Isosporasuis卵囊进行计数，分别稀释成1000个/mL、100个/mL、10个/mL和1个/mL，分别提取基因组DNA，以此为模板，按照步骤二qRT-PCR反应体系及程序分别进行qRT-PCR扩增。步骤五，特异性检验：分别以实验室所保存等孢球虫、艾美耳属球虫、弓形虫及隐孢子虫基因组DNA为模板，按照步骤二qRT-PCR反应体系及程序分别进行qRT-PCR扩增。与已有技术相比，本专利技术的有益效果体现在：本方法以引起仔猪腹泻的猪等孢球虫为研究对象，利用生物信息学及分子生物学技术扩增获得Is-18S-ITS1-5.8S-ITS2-28SrRNA序列，筛选ITS2基因为目的基因，分别优化扩增引物(100nM)及探针浓度(100nM)，成功建立qRT-PCR定量检测方法，通过敏感性及特异性检验，结果证实该方法可以特异性检测到样品中的单个卵囊，较传统检测方法既可提高检测敏感性，又可做到定量分析的效果，因此该方法的建立将为猪球虫病爆发风险评估提供理论依据，对养猪业的发展具有重要意义。附图说明图1为本专利技术Is-HNITS2基因的PCR扩增结果示意图；图2为本专利技术Is-HNITS2基因PCR扩增引物浓度筛选结果示意图；图3为本专利技术Is-HNITS2基因qRT-PCR扩增探针浓度筛选结果示意图；图4为本专利技术Is-HNITS2基因qRT-PCR标准曲线的建立结果；图5为本专利技术Is-HNITS2基因qRT-PCR扩增敏感性检验结果(1-1000个卵囊)；图6为本专利技术Is-HNITS2基因qRT-PCR扩增特异性检测结果(仅等孢球虫呈阳性扩增)。具体实施方式为了使专利技术实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体图示，进一步阐述本专利技术。如图1～图6所示，一种猪等孢球虫qRT-PCR定量检测构建方法，其特征在于：它包括：步骤一，构建Markergene-pMD18-T质粒：利用全长为3957bp的Is-HN18SrRNA-ITS1-5.8S-ITS2-28S基因序列，对基因序列进行生物信息学分析确定全长为433bp的ITS2基因序列为猪等孢球虫所特有的核糖体RNA基因序列，选择ITS2基因为Markergene，以前期所构建的Is-HN18SrRNA-ITS1-5.8S-ITS2-28S-pMD18-T质粒为模板，对Is-HNITS2基因进行PCR扩增，同时以ddH2O为模板作为阴性对照。配制50μLPCR反应体系(2×TaqPCRMasterMix:25μL；上游引物:5’-TGTCTCTGAAGTGTCAAGTTCTGTC-3’,下游引物:5’-TTAAGTTCAGCGGGTAATCTCG-3’各0.5μL，终浓度为1μM；质粒模板1μL；添加ddH2O至50μL)；反应条件为：94℃预变性5min，94℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸30sec，72℃延伸10min，35个循环，取PCR反应产物进行3％琼脂糖凝胶电泳，阳性产物经胶回收试剂盒纯化回收，产物连接至pMD18-T载体，再将连接产物转化入E.coliDH5α感受态细胞，挑取转化子进行菌落PCR鉴定，阳性菌进行测序，测序正确后提取质粒，并测定浓度保存待用。步骤二，筛选及优化qRT-PCR引物及探针：根据测序Is-ITS2基因序列，设计qRT-PCR引物及探针，摸索引物浓度本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种猪等孢球虫qRT‑PCR定量检测构建方法，其特征在于：它包括：步骤一，构建Marker gene‑pMD18‑T质粒：利用全长为3957bp的Is‑HN 18S rRNA‑ITS1‑5.8S‑ITS2‑28S基因序列，对基因序列进行生物信息学分析确定全长为433bp的ITS2基因序列为猪等孢球虫所特有的核糖体RNA基因序列，选择ITS2基因为Marker gene，以前期所构建的Is‑HN 18S rRNA‑ITS1‑5.8S‑ITS2‑28S‑pMD18‑T质粒为模板，对Is‑HN ITS2基因进行PCR扩增，同时以ddH2O为模板作为阴性对照。配制50μL PCR反应体系(2×Taq PCR MasterMix:25μL；上游引物:5’‑TGTCTCTGAAGTGTCAAGTTCTGTC‑3’,下游引物:5’‑TTAAGTTCAGCGGGTAATCTCG‑3’各0.5μL，终浓度为1μM；质粒模板1μL；添加ddH2O至50μL)；反应条件为：94℃预变性5min，94℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸30sec，72℃延伸10min，35个循环，取PCR反应产物进行3％琼脂糖凝胶电泳，阳性产物经胶回收试剂盒纯化回收，产物连接至pMD18‑T载体，再将连接产物转化入E.coli DH5α感受态细胞，挑取转化子进行菌落PCR鉴定，阳性菌进行测序，测序正确后提取质粒，并测定浓度保存待用。步骤二，筛选及优化qRT‑PCR引物及探针：根据测序Is‑ITS2基因序列，设计qRT‑PCR引物及探针，摸索引物浓度，将引物分别稀释成终浓度为50nM、100nM、150nM、200nM和400nM，分别进行PCR扩增，PCR反应条件为：95℃30秒，以下共进行40循环(95℃15sec，60℃15sec，72℃30sec)，16℃终止反应。使用3％的琼脂糖电泳检测PCR产物；将探针分别稀释成终浓度为50nM、100nM、200nM和400nM，分别进行qRT‑PCR，PCR反应条件为：Program1(预变性)：95℃30sec，1cycle；Program2(扩增程序)：95℃5sec，60℃20sec，40cycles。步骤三，建立标准曲线：根据质粒浓度10倍梯度稀释，分别稀释为100ng/μL、10ng/μL、1ng/μL、0.1ng/μL、0.01ng/μL及0.001ng/μL，按照步骤二qRT‑PCR反应体系及程序分别进行qRT‑PCR扩增，建立质粒标准曲线。步骤四，敏感性检验：对实验室所保存纯净Isospora suis卵囊进行计数，分别稀释成1000个/mL、100个/mL、10个/mL和1个/mL，分别提取基因组DNA，以此为模板，按照步骤二qRT‑PCR反应体系及程序分别进行qRT‑PCR扩增。步骤五，特异性检验：分别以实验室所保存等孢球虫、艾美耳属球虫、弓形虫及隐孢子虫基因组DNA为模板，按照步骤二qRT‑PCR反应体系及程序分别进行qRT‑PCR扩增。...

【技术特征摘要】
1.一种猪等孢球虫qRT-PCR定量检测构建方法，其特征在于：它包括：步骤一，构建Markergene-pMD18-T质粒：利用全长为3957bp的Is-HN18SrRNA-ITS1-5.8S-ITS2-28S基因序列，对基因序列进行生物信息学分析确定全长为433bp的ITS2基因序列为猪等孢球虫所特有的核糖体RNA基因序列，选择ITS2基因为Markergene，以前期所构建的Is-HN18SrRNA-ITS1-5.8S-ITS2-28S-pMD18-T质粒为模板，对Is-HNITS2基因进行PCR扩增，同时以ddH2O为模板作为阴性对照。配制50μLPCR反应体系(2×TaqPCRMasterMix:25μL；上游引物:5’-TGTCTCTGAAGTGTCAAGTTCTGTC-3’,下游引物:5’-TTAAGTTCAGCGGGTAATCTCG-3’各0.5μL，终浓度为1μM；质粒模板1μL；添加ddH2O至50μL)；反应条件为：94℃预变性5min，94℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸30sec，72℃延伸10min，35个循环，取PCR反应产物进行3％琼脂糖凝胶电泳，阳性产物经胶回收试剂盒纯化回收，产物连接至pMD18-T载体，再将连接产物转化入E.coliDH5α感受态细胞，挑取转化子进行菌落PCR鉴定，阳性菌进行测序，测序正确后提取质粒，并测定浓度保存待用。步骤二，筛选及优化qRT-PCR引物及探针：...

【专利技术属性】
技术研发人员：戚南山，林栩慧，孙铭飞，廖申权，吕敏娜，吴彩艳，李娟，张健騑，谢明权，
申请(专利权)人：广东省农业科学院动物卫生研究所，
类型：发明
国别省市：广东,44