一种用于检测结直肠癌的引物组及检测方法技术

本发明专利技术提供用于检测结直肠癌的引物组及其检测方法，本发明专利技术的引物包括SEQ ID No.1‑‑SEQ ID No.18,可对EpCAM、HER2、EGFR、CEA、MUC1、CD10、CK8、CK18、CK19基因进行联合检测。通过PCR或荧光定量PCR的方法，可在短时间内灵敏检测出靶基因的表达及表达水平；采用优化的PCR条件，通过增加扩增反应的循环数，使观察结果更显著，进一步提高方法适用性；扩增产物具有特异性，确保PCR和荧光定量PCR检测高准确度和灵敏度。实施本发明专利技术中用于结直肠癌检测的引物组，通过检测病人样本中靶点基因的表达，可以简单、方便且准确地诊断结直肠癌。

Primer set for detecting colorectal cancer and detection method

The invention provides a primer set for detection of colorectal cancer and its detection method, primer of the invention includes SEQ ID No.1 SEQ ID No.18, capable of combination detection of EpCAM, HER2, EGFR, CEA, MUC1, CD10, CK8, CK18, CK19 gene. Through the method of PCR or fluorescent quantitative PCR, in a short period of time sensitive detection and expression level of target gene expression; using the optimized PCR, the cycle number amplification reaction, make the results more significant, further improve the applicability of the method; with specific amplification products, ensure that the PCR and fluorescence quantitative PCR detection high accuracy and sensitivity. A primer set for detecting colorectal cancer is implemented by detecting the expression of target genes in a patient sample, so that the CRC can be diagnosed simply, conveniently and accurately.

【技术实现步骤摘要】
一种用于检测结直肠癌的引物组及检测方法
本专利技术涉及肿瘤基因领域，具体涉及一种用于检测结直肠癌的引物组及检测方法。
技术介绍
结直肠癌是一种常见的恶性肿瘤，全世界新诊断的结直肠癌病例数接近每年一百万。随着经济水平的升高，饮食结构的改变，我国结直肠癌的发病率也日渐增高，已跃居第3～5位；死亡率位居恶性肿瘤死亡谱的第4或第5位。据预测，结直肠癌将成为我国最常见的发病率上升的恶性肿瘤之一，其发病率与死亡率在今后很长一段时期内仍将稳步上升。Morson早在1974年提出“腺瘤—癌变”学说，认为结直肠癌的发生发展必然要经过一个腺瘤的形成过程，其演变约需10—15年。流行病学资料也显示大肠腺瘤性息肉与结直肠癌的发生呈正相关。这一连续性的病理进展需要较长的阶段，即存在较长的癌前病变期。术前无转移者根治后10年生存率可达半数以上。因此结直肠癌早期筛查和诊断非常关键。早期结直肠癌往往无明显症状，从建立的高危人群中筛查病例，使被动接受就诊者转为主动筛查是早期发现结直肠癌的有效途径，相关研究越来越受到国内外学者的重视。结直肠癌的确诊有赖于肠镜及其活检的病理诊断，但内镜属有创检查，可能带来不适和并发症，患者接受程度较低。有效的非侵袭性血液检测可能为发现结直肠癌的理因此对结直肠癌的早期诊断十分必要。目前结直肠癌的诊断方法包括影像学检查，细胞病理学和组织病理学诊断。影像学检查包括CT扫描、核磁共振检查等。通常的细胞和组织病理学检测包括细胞活检，需要通过外科手术或者肠镜的方法从患者上获取肿瘤组织的检材，目前在我国，尚没有普及。目前，临床常用的监测结直肠癌的肿瘤标志物主要有癌胚抗原(CEA)、糖链蛋白19-9(CA19-9)等，用于病理学诊断结直肠癌免疫组化指标有环氧合酶-2(COX-2)、拓扑异构酶II(TOPOII)、Ki67等。CEA由Gold和Freedman从结肠腺癌中提出，为较广谱、非特异性肿瘤标记物，属于人类胚胎抗原决定簇的酸性糖蛋白。CEA已经被医学界接受并且为国际肿瘤学协会推荐，主要用于肿瘤复发的监测。CEA在95％的结直肠、胃和胰腺肿瘤以及多数的乳腺、肺和头颈部肿瘤均有升高。也有报道良性疾病的患者CEA水平升高，以及许多结直肠癌尤其在疾病早期患者CEA水平正常近来，循环肿瘤细胞(CirculatingTumorCells，CTCs)检测的出现给患者的检测带来了新的希望。CTCs是从肿瘤病灶脱离并移位至血液中的肿瘤细胞，是恶性肿瘤患者术后复发和远处转移的重要原因，也是导致肿瘤患者死亡的重要因素。与其他组织学标本如骨髓等相比，外周血标本容易获取，且对患者创伤小，是临床上常规检测较为理想的标本来源。CTCs检测有助于肿瘤的早期诊断、判断患者预后、评估抗肿瘤药物的疗效及制定个体化治疗方案。与传统的诊断方法相比，CTCs检测可更加敏感地发现疾病的变化，且对患者没有副作用。CTC的检测通常通过抽取一定体积的血液进行。检测分为两类，包括不捕获(富集)直接检测和先捕获(富集)后检测，其中后者为主流的检测方法。先捕获(富集)后检测的方法也分为两类，即正选和负选。正选主要是通过CTC表面标志物或细胞的物理性质(大小、密度)进行捕获；前者是基于免疫磁球技术和微流控芯片技术，后者是基于过滤、离心的原理。负选则是通过白细胞表面标志物间接捕获CTC。然而基于先捕获(富集)后检测的方法有着明显的缺陷。它严重依赖于肿瘤细胞表面标记物的表达，因此无法捕获未表达表面肿瘤标记物的CTC细胞。采用RT-PCR的方法检测CTC细胞的特异性基因是CTC细胞检测的另外一种方式。首先抽取一定体积的血液，通过密度梯度离心的方式富集CTCs，然后通过RT-PCR的方式检测特定基因的mRNA，以此判断CTCs是否存在，并通过检测CT值的变化给CTCs定量。这种方法检测CTCs费用低，敏感度高，而且容易自动化。目前RT-PCR方法检测结直肠癌的CTCs检测的标准还没有建立。通过检测结直肠癌患者的CTCs特征基因，能够确定结直肠癌CTCs的检测方法和检测标准。这些方法和标准的建立有助于肿瘤患者的早期诊断、判断患者预后、评估抗肿瘤药物，包括NK和CAR-T免疫治疗的疗效及制定个体化治疗方案。针对上述问题，本专利技术开发一种高灵敏的多基因联合检测的试剂盒，通过联合检测EpCAM、HER2、EGFR、CEA、MUC1、CD10、CK8、CK18、CK199个基因实现肿瘤的早期筛查或诊断。本专利技术设计运用靶向特异性引物组，大幅度提高检测的灵敏度。该检测方法的检出率可达到95％，同时具备了灵敏度高，特异性好，快速准确等优点。
技术实现思路
本专利技术的目的在于针对现有技术的不足，提供一种用于检测结直肠癌的引物组及检测方法。本专利技术的目的是通过以下技术方案实现的,一种用于检测肠癌的引物组，包含：本专利技术的引物组可通过以下两种方法实现神经母细胞瘤的检测。方法1：PCR方法。(1)将权利要求1所述的9对引物分别加入到单个PCR反应管中，并均加入核酸提取物、反转录酶、RNA酶抑制剂、DNA聚合酶、dNTP；其中，PCR反应的每个循环的条件为94摄氏度、30s；55摄氏度、30s；72摄氏度、10s；(2)进行反转录和PCR反应，用琼脂糖凝胶电泳法进行检测。方法2：荧光定量PCR方法(1)将权利要求1所述的9对引物分别加入到单个PCR反应管中，并均加入核酸提取物、反转录酶、RNA酶抑制剂、DNA聚合酶、dNTP；分别加入2×ChamQSYBRqPCRMasterMix，其中，PCR反应的每个循环的条件为95摄氏度、10s和60摄氏度、30s；40个循环；每管设立三个复孔；(2)进行反转录和PCR反应，并实时检测荧光；(3)根据荧光检测结果计算出的Ct值，判断是否有标志物靶基因表达于样品中。本专利技术的有益效果在于：本专利技术通过设计特异性PCR引物，开发出用于肠癌早期检测的多基因联合检测方法。此方法：(1)建立的PCR体系可对EpCAM、HER2、EGFR、CEA、MUC1、CD10、CK8、CK18、CK19基因进行联合检测；(2)通过同时对多个基因进行检测肠癌检出率可达到95％；(3)灵敏度高，低至1-5拷贝的基因表达水平均可检出；(4)特异性强，正常人或非肠癌病人样本不会产生非特异性信号；(5)检测速度快，操作简单，费用低廉。附图说明图1为实施例中健康人外周血样本检测阴性PCR图。图2为实施例中乳腺癌患者外周血样本检测阴性PCR图。图3为实施例中乳腺癌患者癌组织样本检测阴性PCR图。图4为实施例中结直肠癌患者外周血检测阳性PCR图。图5为实施例中结直肠癌患者肠癌组织检测阳性PCR图。图中，M.100bpmarker；1.EpCAM；2.HER2；3.EGFR；4.CEA；5.MUC1；6.CD10；7.CK8；8.CK18；9.CK19；10.B2M。具体实施方式本专利技术针对目前肿瘤中主要的驱动性突变基因，联合检测EpCAM、HER2、EGFR、CEA、MUC1、CD10、CK8、CK18、CK199个基因实现结直肠癌的早期筛查或诊断。针对目前检测方法灵敏度低，检测过程复杂繁琐，检测所需时间长，无法满足临床检测的实际需求。针对上述问题，设计出用于检测上述9个基因的一整套特异性引物组。根据上述9个基因本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于检测结直肠癌的引物组，其特征在于，所述引物组可以包含a～i 9对引物，所述引物a的正向引物如SEQ ID No.1所示，引物a的反向引物如SEQ ID No.2所示，引物b的正向引物如SEQ ID No.3所示，引物b的反向引物如SEQ ID No.4所示，引物c的正向引物如SEQ ID No.5所示，引物c的反向引物如SEQ ID No.6所示，引物d的正向引物如SEQ ID No.7所示，引物d的反向引物如SEQ ID No.8所示,引物e的正向引物如SEQ ID No.9所示，引物e的反向引物如SEQ ID No.10所示,引物f的正向引物如SEQ ID No.11所示，引物f的反向引物如SEQ ID No.12所示,引物g的正向引物如SEQ ID No.13所示，引物g的反向引物如SEQ ID No.14所示,引物h的正向引物如SEQ ID No.15所示，引物h的反向引物如SEQ ID No.16所示,引物i的正向引物如SEQ ID No.17所示，引物i的反向引物如SEQ ID No.18所示。

【技术特征摘要】
1.一种用于检测结直肠癌的引物组，其特征在于，所述引物组可以包含a～i9对引物，所述引物a的正向引物如SEQIDNo.1所示，引物a的反向引物如SEQIDNo.2所示，引物b的正向引物如SEQIDNo.3所示，引物b的反向引物如SEQIDNo.4所示，引物c的正向引物如SEQIDNo.5所示，引物c的反向引物如SEQIDNo.6所示，引物d的正向引物如SEQIDNo.7所示，引物d的反向引物如SEQIDNo.8所示,引物e的正向引物如SEQIDNo.9所示，引物e的反向引物如SEQIDNo.10所示,引物f的正向引物如SEQIDNo.11所示，引物f的反向引物如SEQIDNo.12所示,引物g的正向引物如SEQIDNo.13所示，引物g的反向引物如SEQIDNo.14所示,引物h的正向引物如SEQIDNo.15所示，引物h的反向引物如SEQIDNo.16所示,引物i的正向引物如SEQIDNo.17所示，引物i的反向引物如SEQIDNo.1...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐以兵，李勇，孙倍成，王国胜，陶厚权，朱珍芳，
申请(专利权)人：浙江大学，上海市浦东新区公利医院，南京医科大学第一附属医院，浙江省人民医院，上海博慷生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江,33