本发明专利技术公开了一种人肝细胞癌发生发展相关的长链非编码RNA、扩增检测方法及应用。本发明专利技术首次发现并克隆了一个新的长链非编码RNA基因序列，并通过实验证明该基因在肝细胞癌中的特异性表达与肝细胞癌的恶性程度及转移能力有关，该基因具有肝细胞癌辅助诊断、肝细胞癌基因治疗及肝细胞癌预后预测的用途。发明专利技术也提供了该基因的RNAi靶序列、用于RNAi干扰的短发夹片段，二者具有抑制该基因表达的能力，具有肝细胞癌的辅助诊断和基因治疗的用途。
Long chain non coding RNA amplification detection method and application related to occurrence and development of human hepatocellular carcinoma
The invention discloses a long chain non coding RNA amplification detection method related to the occurrence and development of human hepatocellular carcinoma and its application. The invention was first discovered and cloned a new long non encoding sequence of RNA gene, and the experimental results proved that the specificity of the gene in hepatocellular carcinoma is related to malignant degree and metastasis of hepatocellular carcinoma and liver cancer cells, the gene has aided diagnosis of hepatocellular carcinoma, gene use in predicting the prognosis of treatment and hepatocellular carcinoma. The invention also provides a RNAi target sequence of the gene and a short hairpin fragment for RNAi interference, and the two has the ability to suppress the expression of the gene and has the use of auxiliary diagnosis and gene therapy for hepatocellular carcinoma.
【技术实现步骤摘要】
一种人肝细胞癌发生发展相关的长链非编码RNA、扩增检测方法及应用
本专利技术属于肿瘤分子生物学领域，具体涉及一种人肝细胞癌发生发展相关的长链非编码RNA、扩增检测方法及应用。
技术介绍
肝细胞癌(hepatocellularcarcinoma，HCC)是一种常见的恶性肿瘤，占整个原发性肝癌(LiverCancer)的90％以上。全世界每年发病估计不少于一百万新患者，占恶性肿瘤发病率第6位，死亡率第2位，每年约60万人死于肝癌。据全国的几次死亡回顾调查显示我国70年代、90年代及21世纪初的肝癌在全部恶性肿瘤死亡中占前3位，是威胁健康和生命的主要疾病之一。我国HCC多发生在慢性肝炎或肝硬化的基础上，高度恶性和复杂难治；且我国人口基数大的事实，HBV、HCV感染人群的增加及人口老龄化，今后一段时间内肝癌的发生率可能仍将上升。肝癌患者的预后差，俨然已严重威胁世界和我国人民的健康和生命，也给患者家属带来了沉重的经济负担和精神压力。因此，研究HCC的发病机制、新型治疗靶点及早期诊断/预后生物标记物迫在眉睫。长链非编码RNAs(Longnon-codingRNAs，lncRNAs)是一类长度大于200nucleotides(nt)的不具备编码蛋白质能力的功能性RNA分子，其具有许多类似mRNA的结构，如poly(A)尾、5’帽子结构和启动子。它位于细胞核或者细胞质中，可被选择性剪接或聚腺苷酸化。LncRNAs曾被认为是基因转录过程中的“噪音”。但随着高通量测序和其它新兴研究技术的涌现，lncRNAs的生物学功能逐渐被研究并得到认可。越来越多的证据表明lncRNAs在广泛的生物学过程中发挥重要作用，其包含细胞生长、迁移、侵袭和分化等。然而，lncRNAs在人类肝细胞癌中的生物学功能和分子机制有待阐明。2015年美国总统奥巴马宣布精准医学计划(PrecisionMedicineInitiative)的启动，引起了全世界的广泛关注。精准医学(PrecisionMedicine)是以个性化医疗为基础，联合最新分子遗传学检测技术对遗传物质及相关分子进行检测，这就要求我们探索更多的新型分子，以更深入、更准确和更全面地反映疾病(肝细胞癌也不例外)的本质特征，为疾病诊断和治疗以及健康管理。
技术实现思路
本专利技术旨在克服现有技术的不足，提供一种人肝细胞癌发生发展相关的长链非编码RNA、扩增检测方法及应用。为实现本专利技术的上述目的，本专利技术采用如下的技术方案：本专利技术所述人肝细胞癌发生发展相关的长链非编码RNA的序列如SEQIDNO.1所示，将其在NCBI数据库中进行比对，发现其是在LOC105371083的基础上5’延长了86个核苷酸(catgcgtagataaaagtaaataaacgccctcaagttaggaatgaacggaggaaatgggttaaacgagaataaataattgaaggcaga)，3’增加了多聚A尾(aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa)。该长链非编码RNA可用于制备诊断、治疗或预后预测肝细胞癌试剂或药物。该长链非编码RNA的DNA序列如SEQIDNO.6所示。用于该长链非编码RNA中siRNA的作用靶序列的序列如SEQIDNO.7至SEQIDNO.10任一所示。这些靶序列可用于制备诊断、治疗或预后预测肝细胞癌疾病的药物。用于该长链非编码RNA中RNAi用的短发夹片段shRNA的序列如SEQIDNO.11或SEQIDNO.12所示。这些短发夹片段shRNA可用于制备诊断、治疗或预后预测肝细胞癌疾病的药物。以上这些序列可以进一步构建成载体或重组子。扩增、检测上述长链非编码RNA的试剂盒中包含3’RACE引物3L5、3’RACE巢式PCR引物3L5N、5’RACE引物5L5、5’RACE巢式PCR引物5L5N；所述3’RACE引物3L5序列如SEQIDNO.2所示，所述3’RACE巢式PCR引物3L5N序列如SEQIDNO.3所示，所述5’RACE引物5L5序列如SEQIDNO.4所示，所述5’RACE巢式PCR引物5L5N序列如SEQIDNO.5所示。基于上述试剂盒扩增、检测本专利技术所述长链非编码RNA的方法包括如下步骤：(1)以人肝细胞癌HepG2细胞RNA为模板，用3’RACE引物3L5、3’RACE巢式PCR引物3L5N进行PCR获得3’RACE产物；以人肝细胞癌HepG2细胞RNA为模板，用5’RACE引物5L5、5’RACE巢式PCR引物5L5N进行PCR获得5’RACE产物；(2)将3’RACE产物与5’RACE产物拼接，获得长链非编码RNA。下面对本专利技术作进一步说明：本专利技术研究中，构建lncRNA(命名为lncRNAHCCL5)的过表达载体，并转染人肝细胞癌细胞HepG2和SMMC-7721，结果表明lncRNAHCCL5过表达能明显增加肝细胞癌细胞的恶性生物学行为，提高其侵袭转移能力。针对lncRNAHCCL5基因设计RNAi靶序列，合成siRNA进行有效干扰位点的筛选，获得有效位点后设计了用于RNAi的短发夹片段，构建相应的shRNA质粒表达载体，并转染人肝细胞癌细胞SMMC-7721和HCCLM3，结果表明在肝细胞癌细胞中表达相应的shRNA能降解细胞内源性lncRNAHCCL5并抑制肝细胞癌细胞的发生发展和转移，减少其恶性程度。通过上述工作可提供lncRNA相关的高效干扰位点，可用于shRNA表达载体构建与siRNA的合成，以及相关基因治疗制剂。本专利技术证明了该lncRNA基因具有评估肝细胞癌发生发展的作用，并可以作为肿瘤预后相关的标志物，用于肝细胞癌的辅助诊断；shRNA靶序列及用于RNAi的短发夹片段具有基因治疗的作用，可以用作肝细胞癌的基因治疗。本专利技术所述的长链非编码RNA基因克隆自肝细胞癌细胞，但不仅限于肝细胞癌，未来更多研究将提供在其他恶性肿瘤中应用。在精准医学的指导下，本专利技术通过电子克隆技术对肝细胞癌未知基因进行筛选，cDNA末端快速扩增技术(rapid-amplificationofcDNAends，RACE)克隆肝细胞癌新lncRNA的全长，Northernblotting验证了其大小，核质分离试剂盒检测其细胞定位；RT-PCR、Westernblot、裸鼠成瘤等技术/方法从细胞、裸鼠和患者三个层次观察发现，lncRNAHCCL5可促进肝细胞癌的发生发展。该课题有望寻找肝细胞癌的治疗靶点、预后预测和预防的生物标记物提供新的线索，可为肝细胞癌的“精准医学”事业贡献一分力量。此外，通过抑制lncRNAHCCL5表达进行基因治疗，具有重要的实用价值。为开发肝细胞癌相关的长链非编码RNA及其shRNA在肝细胞癌诊疗方面的应用，本专利技术提供了一条新的肝细胞癌相关的长链非编码RNA及其相关的特异性shRNA序列，该序列可以用于肝细胞癌相关的诊断、治疗和预后预测。综上所述，本专利技术首次发现并克隆了一个新的长链非编码RNA基因序列，并通过实验证明该基因在肝细胞癌中的特异性表达与肝细胞癌的恶性程度及转移能力有关，该基因具有肝细胞癌辅助诊断、肝细胞癌基因治疗及肝细胞癌预后预测的用途。专利技术也提供了该基因的RNAi靶序列、用于RNAi干扰的短发夹片段，二者具有抑制该基因表达的能力，具有肝细本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种人肝细胞癌发生发展相关的长链非编码RNA，其特征在于，所述长链非编码RNA的序列如SEQ ID NO.1所示。
【技术特征摘要】
1.一种人肝细胞癌发生发展相关的长链非编码RNA，其特征在于，所述长链非编码RNA的序列如SEQIDNO.1所示。2.一种扩增、检测权利要求1所述长链非编码RNA的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包含3’RACE引物3L5、3’RACE巢式PCR引物3L5N、5’RACE引物5L5、5’RACE巢式PCR引物5L5N；所述3’RACE引物3L5序列如SEQIDNO.2所示，所述3’RACE巢式PCR引物3L5N序列如SEQIDNO.3所示，所述5’RACE引物5L5序列如SEQIDNO.4所示，所述5’RACE巢式PCR引物5L5N序列如SEQIDNO.5所示。3.基于权利要求2所述试剂盒扩增、检测权利要求1所述长链非编码RNA的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：(1)以人肝细胞癌HepG2细胞RNA为模板，用3’RACE引物3L5、3’RACE巢式PCR引物3L5N进行PCR获得3’RACE产物；以人肝细胞癌HepG2细胞RNA为模板，用5’RACE引物5L5、5’RACE巢式PC...
【专利技术属性】
技术研发人员：彭丽，李官成，蒋斌元，袁小青，
申请(专利权)人：中南大学，
类型：发明
国别省市：湖南,43
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