从稻种中快速检测水稻恶苗病病菌的LAMP法及试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种用于水稻恶苗病病菌快速检测方法的LAMP特异性引物组合物，LAMP特异性引物组合物由上下游外引物F3、B3以及上下游内引物FIP、BIP这四条引物组成。本发明专利技术还同时公开了环介导等温扩增试剂盒及相应的环介导等温扩增方法：方法一、先在扩增前加入染料羟基萘酚蓝作为反应指示剂，然后进行LAMP扩增反应；反应结束后，颜色发生变化，判断为阳性，反之判断为阴性；方法二、取扩增产物，用2％琼脂糖凝胶电泳检测，如果出现梯形条带判断为阳性，反之判断为阴性。

Method and kit for rapid detection of LAMP bacteria from rice bakanae disease of rice

The invention discloses a LAMP specific primer composition for the rapid detection method of rice bakanae disease pathogen, LAMP specific primer composition by outer primers F3, B3 and the downstream upstream and downstream primers FIP, BIP in the four primers. The invention also discloses a loop mediated isothermal amplification kit and loop mediated isothermal amplification method: the corresponding guide method, first in the hydroxynaphthol blue dye was added before the reaction indicator, then amplified by LAMP; after the reaction, color change, judged as positive, negative and judgment method; two and the PCR product was examined by 2% agarose gel electrophoresis, if the ladder was judged as positive, otherwise negative judgment.

【技术实现步骤摘要】
从稻种中快速检测水稻恶苗病病菌的LAMP法及试剂盒
本专利技术属于植物真菌分子生物学检测
，涉及用环介导等温扩增(LAMP)技术检测水稻恶苗病菌菌的环介导等温扩增引物组及其使用方法，属于植物病害检测、鉴定及防治的早期预警

技术介绍
水稻恶苗病是一种传性真菌病害，在各个水稻主产区均有发生，苗期到抽穗期都可发生，发病轻的田块减产5-50％。该病害主要是由藤仓镰孢菌(Fusraium.fujikuroi)侵染引起，携带有病原菌的种子是水稻恶苗病的主要侵染源，如若将带菌的种子和将健康的种子一起浸种，无病种子会被污染。当种子长出新芽，病菌就能通过芽鞘侵入幼苗，随着带菌幼苗的生长，菌丝逐渐蔓延至全株，并出现一系列的症状，如节间伸长，节部曝露与叶鞘外，分蘖能力削弱，叶色发黄，根系发育异常。发病程度轻的植株提早抽穗，穗形小而不实。在抽穗期，也可能发生病害，严重时谷穗变褐，无法结实。在稻株抽穗后的21天内稻谷感染病菌的机率是最高的，在脱粒时带菌的种子成为下一季的初侵染源。因此建立水稻恶苗病菌快速检测体系，早期对被感染的水稻种子进行快速准确检测，对预测病害发生情况、及时采取有效的防治措施控制病原菌的传播和流行、减少经济损失都具有重要的理论和实际意义。目前对水稻恶苗病菌的检测大多仍沿用传统的组织分离培养及形态学鉴定方法，但是，这种鉴定方法耗时长，一般完成一次检测要一周以上，工作量大，并且分离成功率不高，有着很大的局限性。若所分离的病害样本不新鲜，则更难确诊病原菌，难以满足对水稻恶苗病诊断的实际需要，这对病原菌的检测和防控十分不利。随着核酸相关的鉴定方法不断发展，基于普通PCR的方法已经成功用于病原菌的检测，但PCR法特异性等检测耗时偏长，需要6～8h，同时PCR方法需要昂贵仪器PCR仪，检测过程较繁杂。且大多数PCR检测方法都是用病菌的培养物进行，前期需要进行病菌的分离、培养和纯化，无法进行现场检测，实际应用意义不大。环介导等温扩增技术(Loop-mediatedisothermalamplification，LAMP)是日本荣研株式会社专利技术的一种新的核酸扩增技术，因为其扩操作简便、快速、特异性高、成本低等优点，成为可以替代PCR的新的核酸扩增技术。它是针对靶基因的6个区域设计4对特异性引物，在Bst大片段聚合酶的作用下引起自循环链置换反应，60-65℃范围60min内，能大量合成目标DNA。扩增产物的检测一般采用荧光染料目测观察、琼脂糖凝胶电泳和浊度观察等方法。由于LAMP扩增过程依赖识别靶序列6个独立区域，所以反应特异性很强，并且核酸扩增过程是在恒温条件下进行，普通水浴锅或者等温保温瓶就能满足反应要求，检测成本降低，所需时间短。由于反应简单、快速、高效、经济等特征，因而具有极为广泛的应用前景。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一套用于检测水稻恶苗病菌的环介导等温扩增引物组合物和含有该引物的试剂盒，以及提供一种从稻种中快速检测水稻恶苗病病菌的LAMP法。为了解决上述技术问题，本专利技术提供如下一种检测水稻恶苗病菌的LAMP引物组合物，由上下游外引物，上下游内引物四条引物组成，引物序列如下：上游外引物(F3)：5’—CGGCCCTTATACCCCATTC—3’；下游外引物(B3)：5’—GCGCCACTATTGCTGTCT—3’；上游内引物(FIP)：5’—ACTTGCGCTGGAAAGACCAGAACATCCGCCACCTCACTGA—3’；下游内引物(BIP)：5’—GGTCACCAATCCTCGGCTACAGCCCTAGGAGATGGTCGCTTA—3’。本专利技术还同时提供了一种用于检测水稻恶苗病病菌环介导等温扩增试剂盒，包含上述LAMP特异性引物组合物。作为本专利技术的试剂盒的改进：包含1.6μM的正内向引物FIP，1.6μM的反向内引物BIP、0.2μM正向外引物F3、0.2μM反向外引物B3；还包含：10×ThermoPolBuffer、1mmol/LdNTPs、4mmol/LMgCl2、0.6mmol/L甜菜碱、150mmol/L羟基萘酚蓝(HNB)、8U/μLBstDNA聚合酶、ddH2O。即，LAMP试剂盒包含环介导等温扩增引物混合液和环介导等温扩增反应预混液构成的检测溶液，引物组合混合液浓度为：1.6μM的正内向引物FIP，1.6μM的反向内引物BIP、0.2μM正向外引物F3、0.2μM反向外引物B3；环介导等温扩增反应预混液：10×ThermoPolBuffer、1mMdNTPs、4mMMgCl2、0.6M甜菜碱、150μM羟基萘酚蓝(HNB)、8U/μLBstDNA聚合酶、ddH2O。本专利技术还提供上述引物组合或所述试剂盒在检测水稻种子带菌情况的应用。本专利技术还同时提供了用于检测水稻恶苗病病菌的环介导等温扩增方法，检测溶液共24μL，加入待测DNA模板1μL，构成25μL检测反应体系；所述25μL反应体系含有8U/μL的BstDNA聚合酶0.5μL(4U)、10×ThermoPolBuffer2.5μL、20μM的FIP引物2.0μL、20μM的BIP引物2.0μL、10μM的F3引物0.5μL、10μM的B3引物0.5μL、25mM的MgCl24.0μL、10mM的dNTPs2.5μL、5M的甜菜碱3.0μL、3.75mM的羟基萘酚蓝(HNB)1μL、DNA模板1μL，双蒸水补足至25μL；利用上述25μL检测反应体系进行LAMP扩增反应；LAMP扩增反应程序为：63℃，60min；80℃，10min。作为本专利技术的环介导等温扩增方法的改进：利用上述25μL检测反应体系进行LAMP扩增反应，选择以下任一方法：方法一、先在扩增前加入染料羟基萘酚蓝(HNB)作为反应指示剂，以HNB的颜色变化做为结果判定标准，然后进行LAMP扩增反应；反应结束后，颜色发生变化，即显色结果观察到天蓝色判断为阳性，即判定为待测水稻含水稻恶苗病病菌；颜色没有发生变化，显色结果仍为蓝紫色判断为阴性，即判定为待测水稻无水稻恶苗病病菌、或待测水稻所含水稻恶苗病病菌含量未达检测的最低检测浓度0.01ng/μL；方法二、取5～10μL扩增产物，用2％琼脂糖凝胶电泳检测，如果出现梯形条带判断为阳性，即判定为待测水稻含水稻恶苗病病菌；如果无扩增条带则判断为阴性，即判定为待测水稻无水稻恶苗病病菌，或待测水稻所含水稻恶苗病病菌未达最低检测浓度10fg/μL。本专利技术的方案包括：(1)根据水稻恶苗病病菌NPRS31基因的DNA序列设计特异性引物；(2)LAMP扩增及扩增产物的检测；(3)LAMP引物的特异性检测；(4)LAMP扩增和PCR扩增灵敏性比较；(5)水稻种子携带恶苗病病菌的检测。本专利技术的方案具体如下：1、引物的设计：专利技术人首先获得了水稻恶苗病菌的NPRS31基因序列，可使用primerexplorerV5(http://primerexplorer.jp/lampv5e/index.html)设计多组引物，然后根据引物所在序列区域的保守性、引物的发夹结构、二聚体GC含量以及Tm值等综合因素进一步选择引物。最后为水稻恶苗病病菌选择了4条引物，包括2条外引物(F3和B3)和2条内引物(FIP和BIP)。所述引物信息见表1。本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于水稻恶苗病病菌快速检测方法的LAMP特异性引物组合物，其特征在于：所述LAMP特异性引物组合物由上下游外引物、上下游内引物这四条引物组成；上游外引物(F3)：5’—CGGCCCTTATACCCCATTC—3’；下游外引物(B3)：5’—GCGCCACTATTGCTGTCT—3’；上游内引物(FIP)：5’—ACTTGCGCTGGAAAGACCAGAACATCCGCCACCTCACTGA—3’；下游内引物(BIP)：5’—GGTCACCAATCCTCGGCTACAGCCCTAGGAGATGGTCGCTTA—3’。

【技术特征摘要】
1.用于水稻恶苗病病菌快速检测方法的LAMP特异性引物组合物，其特征在于：所述LAMP特异性引物组合物由上下游外引物、上下游内引物这四条引物组成；上游外引物(F3)：5’—CGGCCCTTATACCCCATTC—3’；下游外引物(B3)：5’—GCGCCACTATTGCTGTCT—3’；上游内引物(FIP)：5’—ACTTGCGCTGGAAAGACCAGAACATCCGCCACCTCACTGA—3’；下游内引物(BIP)：5’—GGTCACCAATCCTCGGCTACAGCCCTAGGAGATGGTCGCTTA—3’。2.用于检测水稻恶苗病病菌的环介导等温扩增试剂盒，其特征在于包含如权利要求1所述的LAMP特异性引物组合物。3.根据权利要求2所述的环介导等温扩增试剂盒，其特征在于：包含1.6μM的正内向引物FIP，1.6μM的反向内引物BIP、0.2μM正向外引物F3、0.2μM反向外引物B3。4.根据权利要求2或3所述的环介导等温扩增试剂盒，其特征在于所述试剂盒还包含：10×ThermoPolBuffer、1mmol/LdNTPs、4mmol/LMgCl2、0.6mmol/L甜菜碱、150mmol/L羟基萘酚蓝、8U/μLBstDNA聚合酶、ddH2O。5.用于检测水稻恶苗病病菌的环介导等温扩增方法，其特征在于：LAMP反应体系为25...

【专利技术属性】
技术研发人员：张传清，张书亚，李玲，祝倩菲，朱国念，
申请(专利权)人：浙江农林大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33