The invention discloses a batch detection of plasma or serum sugar type IgG pretreatment method, which comprises the following steps: plasma or serum IgG extraction, IgG cut sugar, sugar chain markers, labeled and purified labeled sugar chain, volatile dry whole plate. With the invention of the traditional single glycoprotein (IgG) samples were cut IgG sugar sugar chain 2 purified AB labeled sugar chain labeled carbohydrate purification steps compared to the invention in 2 AB made the purification steps of sugar chain, greatly reducing the processing time of the sample, but also the cost is saved, the the whole board operation to reduce the loss to the sample transfer and tedious steps, and can quickly and efficiently deal with 96 plasma (or serum) samples.
【技术实现步骤摘要】
一种血浆或血清的IgG糖型检测批量前处理方法
本专利技术涉及生物分析领域的糖蛋白糖型检测样品前处理方法,特别涉及血浆(或血清)IgG2-AB标记的糖型检测批量前处理方法。
技术介绍
蛋白质糖基化是一种非常重要的蛋白质翻译后修饰方式。真核细胞中约有一半的蛋白质发生过糖基化。蛋白质糖基化不仅赋予蛋白质特定的理化性质(如溶解性和稳定性),更重要的是参与凝血、免疫、细胞生长、分泌和信号传导等生理活动。蛋白质糖基化异常与许多疾病密切相关,比如恶性肿瘤、风湿性关节炎和阿尔茨海默病等。蛋白质糖基化也为肿瘤早期诊断和治疗提供依据,绝大多数临床用肿瘤标记物和蛋白质类药物是糖蛋白。因此,研究蛋白质糖基化不仅可以加深对糖蛋白的生物功能的认识,而且对探讨疾病发生、发现疾病标记物和开发新药具有重要意义。免疫球蛋白(英文全称,IgG),又称抗体是一种很重要的糖蛋白,主要分布在血清中。它由两条相同的分子量较小的轻链和两条分子量较大的重链通过二硫键连接而成,抗体的糖链位于重链FC片段上,为N-连接糖。IgG的糖基化对于调节IgG的细胞毒性和抗炎、促炎等炎性潜力非常关键。自身免疫状态和IgG抗体的特定糖基化模式之间的联系已在患类风湿性关节炎和几自身免疫血管炎的患者中被观察到,其中已报道与IgG抗体的降低的半乳糖基化和唾液酸化相关。对IgG糖链结构分析已成为当前研究的热点。陶磊等人(《药物分析杂志》,2011年第11期)分析IgG1型单抗中糖链切除对其结构与功能的影响,结果表明糖链切除后抗体的圆二色谱发生改变,抗原结合能力下降,体外CDC活性基本消失。然而糖链结构中富含多羟基且基本不含发色团 ...
【技术保护点】
一种从血浆或血清的IgG上批处理切除糖链和纯化的方法,步骤包括:(1)IgG提取:通过96孔Protein G提取板将血浆或血清IgG提取至2mL96孔收集板中,测定蛋白浓度后,取出250‑350μL IgG溶液或120‑180μg IgG于1.1mL 96孔深孔板中整板挥干;(2)IgG切糖:在深孔板中加入变性剂变性蛋白后调节溶液pH至8.0,加入糖苷酶或切糖酶进行切除糖链;(3)糖链标记:在挥干的深孔板中加入2‑AB标记溶液,65℃反应3小时,进行2‑AB标记;(4)标记后纯化:深孔板加入乙腈溶液,上清液转移至96孔糖链纯化板,除去多余的标记试剂,在深孔板中收集洗脱出的被标记糖链,整板挥干;其中,步骤2)中变性剂为SDS溶液,并在60℃变性反应10min,或变性剂为Igepal溶液,并在室温变性反应10分钟;以及加入的糖苷酶或切糖酶的质量g与蛋白质的质量g比约1:50~1:30;步骤3)中,每孔加入的标记溶液为0.5mg的2‑AB和1.2mg的氰基硼氢化钠,并且所述2‑AB和氰基硼氢化钠预先配制在含30%乙酸的DMSO溶液中;步骤4)中,去除多余标记试剂所用清洗液为96%的乙腈溶液 ...
【技术特征摘要】
1.一种从血浆或血清的IgG上批处理切除糖链和纯化的方法,步骤包括:(1)IgG提取:通过96孔ProteinG提取板将血浆或血清IgG提取至2mL96孔收集板中,测定蛋白浓度后,取出250-350μLIgG溶液或120-180μgIgG于1.1mL96孔深孔板中整板挥干;(2)IgG切糖:在深孔板中加入变性剂变性蛋白后调节溶液pH至8.0,加入糖苷酶或切糖酶进行切除糖链;(3)糖链标记:在挥干的深孔板中加入2-AB标记溶液,65℃反应3小时,进行2-AB标记;(4)标记后纯化:深孔板加入乙腈溶液,上清液转移至96孔糖链纯化板,除去多余的标记试剂,在深孔板中收集洗脱出的被标记糖链,整板挥干;其中,步骤2)中变性剂为SDS溶液,并在60℃变性反应10min,或变性剂为Igepal溶液,并在室温变性反应10分钟;以及加入的糖苷酶或切糖酶的质量g与蛋白质的质量g比约1:50~1:30;步骤3)中,每孔加入的标记溶液为0.5mg的2-AB和1.2mg的氰基硼氢化钠,并且所述2-AB和氰基硼氢化钠预先配制在含30%乙酸的DMSO溶液中;步骤4)中,去除多余标记试剂所用清洗液为96%的乙腈溶液,洗脱标记的糖链为超纯水。2.权利要求1的方法,其中步骤1)中还包括IgG提取板前处理、IgG结合和清洗、IgG洗脱、IgG提取板再生和保护。3.权利要求2的方法,其中所述IgG提取板前处理方法为:①用2毫升超纯水清洗板子-真空泵抽滤,去除废液;②用2毫升1×PBS清洗板子-真空泵抽滤,去除废液;③用1毫升0.1M甲酸溶液清洗板子-真空泵抽滤,去除废液;④用2毫升10×PBS进行板子的中和-真空泵抽滤,去除废液;⑤用4毫升1×PBS平衡板子-真空泵抽滤,去除废液。4.权利要求2或3的方法,其中所述IgG结合和清洗方法为:用2毫升1×PBS清洗板子-真空泵抽滤,去除废液。再重复2次。5.权利要求2或3的方法,其中所述IgG洗脱的方法为:①用1毫升0.1M甲酸溶液洗脱IgG-真空泵抽滤,收集洗脱液;②向收集板中加入170μL中和缓冲液,并用枪头混匀;③用锡箔纸将收集板盖好,放在震荡器轻微摇晃,避免交叉污染,直至检测样品浓度。④在其他具体实施方案中,所述IgG提取板再生和保护的方法为:⑤用2毫升0....
【专利技术属性】
技术研发人员:黄亚娟,马庆伟,王嵬,王友信,王皓,曲海霞,
申请(专利权)人:北京毅新博创生物科技有限公司,
类型:发明
国别省市:北京,11
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