一种血浆或血清的IgG糖型检测批量前处理方法技术

技术编号:15936723 阅读:48 留言:0更新日期:2017-08-04 20:39
本发明专利技术公开了一种血浆或血清IgG糖型检测的批量前处理方法,其步骤包括:血浆或血清IgG提取、IgG切糖、糖链标记、标记后纯化得到被标记糖链,整板挥干。本发明专利技术与传统的单个糖蛋白(IgG)样品进行IgG切糖‑糖链纯化‑2‑AB标记糖链‑标记后糖链纯化步骤相比,本发明专利技术在2‑AB前省去了糖链的纯化步骤,大大缩减了样品前处理时间,还节约了成本,采用整板操作减少了样品转移的损失及繁冗步骤,能同时快速高效地处理96份血浆(或血清)样品。

Batch detection method of IgG sugar type in plasma or serum

The invention discloses a batch detection of plasma or serum sugar type IgG pretreatment method, which comprises the following steps: plasma or serum IgG extraction, IgG cut sugar, sugar chain markers, labeled and purified labeled sugar chain, volatile dry whole plate. With the invention of the traditional single glycoprotein (IgG) samples were cut IgG sugar sugar chain 2 purified AB labeled sugar chain labeled carbohydrate purification steps compared to the invention in 2 AB made the purification steps of sugar chain, greatly reducing the processing time of the sample, but also the cost is saved, the the whole board operation to reduce the loss to the sample transfer and tedious steps, and can quickly and efficiently deal with 96 plasma (or serum) samples.

【技术实现步骤摘要】
一种血浆或血清的IgG糖型检测批量前处理方法
本专利技术涉及生物分析领域的糖蛋白糖型检测样品前处理方法,特别涉及血浆(或血清)IgG2-AB标记的糖型检测批量前处理方法。
技术介绍
蛋白质糖基化是一种非常重要的蛋白质翻译后修饰方式。真核细胞中约有一半的蛋白质发生过糖基化。蛋白质糖基化不仅赋予蛋白质特定的理化性质(如溶解性和稳定性),更重要的是参与凝血、免疫、细胞生长、分泌和信号传导等生理活动。蛋白质糖基化异常与许多疾病密切相关,比如恶性肿瘤、风湿性关节炎和阿尔茨海默病等。蛋白质糖基化也为肿瘤早期诊断和治疗提供依据,绝大多数临床用肿瘤标记物和蛋白质类药物是糖蛋白。因此,研究蛋白质糖基化不仅可以加深对糖蛋白的生物功能的认识,而且对探讨疾病发生、发现疾病标记物和开发新药具有重要意义。免疫球蛋白(英文全称,IgG),又称抗体是一种很重要的糖蛋白,主要分布在血清中。它由两条相同的分子量较小的轻链和两条分子量较大的重链通过二硫键连接而成,抗体的糖链位于重链FC片段上,为N-连接糖。IgG的糖基化对于调节IgG的细胞毒性和抗炎、促炎等炎性潜力非常关键。自身免疫状态和IgG抗体的特定糖基化模式之间的联系已在患类风湿性关节炎和几自身免疫血管炎的患者中被观察到,其中已报道与IgG抗体的降低的半乳糖基化和唾液酸化相关。对IgG糖链结构分析已成为当前研究的热点。陶磊等人(《药物分析杂志》,2011年第11期)分析IgG1型单抗中糖链切除对其结构与功能的影响,结果表明糖链切除后抗体的圆二色谱发生改变,抗原结合能力下降,体外CDC活性基本消失。然而糖链结构中富含多羟基且基本不含发色团,呈电中性等性质,使得糖类分析非常困难、复杂结构的检测更是异常艰难。因此,需要快速、简单且精确的方式分析糖链结构的技术,并且通过各种方法进行糖链分析。为了进行糖链分析,必须首先从包含在生物样品中分离纯化糖链。一般是将糖蛋白上的糖链切掉并分离纯化后进行分析。因为糖链本身没有发色基团,而且其在质谱仪上不易离子化,为了在分离纯化和结构鉴定过程中能够更有效地检测到糖链,一般进行柱前衍生的方法。该方法主要是对糖链进行标记,使糖链带上紫外或荧光基团,提高检测的灵敏度,同时又可以使糖链带上疏水基团,降低糖链的极性,使糖链在反相色谱柱上得到保留,利于糖链的分离。目前对糖链进行衍生化标记的试剂主要包括2-AB标记衍生糖链的方法。中国专利申请201410844142.6、专利技术名称“快速全面检测单克隆抗体N糖基化位点上寡糖的方法”公开了通过酶解反应切除寡糖,然后使用2-AB溶液标记寡糖,纯化寡糖后通过LC-荧光-ESI-MS分析。然而,该方法需要通过氨丙基固相萃取柱进行纯化,过柱纯化步骤复杂并且成本较高,因此不适于批处理切除糖链和2-AB标记及纯化。此外,陶磊等人同时公开了从抗体或蛋白上切除或测定糖链的方法。然而,该方法也需要色谱柱或过柱纯化,导致不能高通量或批处理,因此限制了批处理切除糖链和2-AB标记及纯化。中国专利申请200610084289.5、专利技术名称“糖链切除装置”公开了用于从碱溶液中切除糖链的装置,包括反应槽和分离纯化的离子交换柱。然而,该装置只适于从复合碳水化合物中切除糖链,且整个装置包括复杂的构成部件,因此也不适于批处理切除糖链和2-AB标记及纯化。另外,使用2-AB试剂标记糖链的一般步骤为:(1)通过糖苷酶从糖蛋白切除糖链;(2)对获得的糖链进行纯化;(3)2-AB标记糖链;(4)标记后糖链的纯化,也就是传统的二步纯化法。其中,对于血清或血浆IgG的糖链分析,还需IgG的分离纯化步骤。因此对于血清(或血浆)IgG的糖链分析,相当于需要进行三次糖链纯化,其中在标记之前必须纯化糖链,否则可能出现杂质干扰,导致标记不完全,因此二步法存在步骤繁琐并且可能造成糖链产物的损失。同时,在一些现有技术中,在酶切前需要更换缓冲液,否则导致切糖酶活性变弱,切糖不充分,从而不能保证检测结果的灵敏度和准确度。因此,目前需要一种能够降低成本、简化步骤,且适用批处理切除糖链和2-AB标记及纯化的方法,该方法应当适用于质谱或色谱检测用的检测平板或微孔板。
技术实现思路
本专利技术原理之一在于:本专利技术不再遵循先纯化糖链后进行标记的传统方法,而是直接进行标记后再进行纯化。由于相对于昂贵的抗体及其糖链样品而言,2-AB试剂更为廉价,因此在确保切除的糖链充分被2-AB试剂标记后再进行纯化,能够有效提高标记效率和产率。本专利技术原理之二在于:在进行标记时,为了糖链混合物中的杂质影响标记,通过优化标记反应参数,尽可能使得标记效率达到或基本达到常规的纯化环境中的标记效率,从而通过因取消纯化糖链步骤而客观上提高或基本提高糖链的标记效率。本专利技术原理之三在于:通过摸索2-AB与氰基硼氢化钠的配比,选择最适的配比,从而在保证足够的标记效率的情况下,减少荧光剂的使用,有效减少了成本。本专利技术原理之四在于:还可联合使用已有的ProteinG提取板,对血浆(或血清)IgG进行快速纯化和高效分离,从而能够实现快速、高通量的批处理过程。因此,本专利技术目的是提供一种从血浆或血清的IgG上批处理切除糖链和纯化的方法,步骤包括:(1)IgG提取:通过96孔ProteinG提取板将血浆或血清IgG提取至2mL96孔收集板中,测定蛋白浓度后,取出250-350μLIgG溶液或120-180μgIgG于1.1mL96孔深孔板中整板挥干;(2)IgG切糖:在深孔板中加入变性剂变性蛋白后调节溶液pH至8.0,加入糖苷酶或切糖酶进行切除糖链;(3)糖链标记:在挥干的深孔板中加入2-AB标记溶液,65℃反应3小时,进行2-AB标记;(4)标记后纯化:深孔板加入乙腈溶液,上清液转移至96孔糖链纯化板,除去多余的标记试剂,在深孔板中收集洗脱出的被标记糖链,整板挥干;其中,步骤2)中变性剂为SDS溶液,并在60℃变性反应10min,或变性剂为Igepal溶液,并在室温变性反应10分钟;以及加入的糖苷酶或切糖酶的质量g与蛋白质的质量g比约1:50~1:30;步骤3)中,每孔加入的标记溶液为0.5mg的2-AB和1.2mg的氰基硼氢化钠,并且所述2-AB和氰基硼氢化钠预先配制在含30%乙酸的DMSO溶液中;步骤4)中,去除多余标记试剂所用清洗液为96%的乙腈溶液,洗脱标记的糖链为超纯水。在一个实施方案中,步骤1)中还包括IgG提取板前处理、IgG结合和清洗、IgG洗脱、IgG提取板再生和保护。在一个具体实施方案中,所述IgG提取板前处理方法为:①用2毫升超纯水清洗板子-真空泵抽滤,去除废液;②用2毫升1×PBS清洗板子-真空泵抽滤,去除废液;③用1毫升0.1M甲酸溶液清洗板子-真空泵抽滤,去除废液;④用2毫升10×PBS进行板子的中和-真空泵抽滤,去除废液;⑤用4毫升1×PBS平衡板子-真空泵抽滤,去除废液。在另一具体实施方案中,所述IgG结合和清洗方法为:用2毫升1×PBS清洗板子-真空泵抽滤,去除废液。再重复2次。在其他具体实施方案中,所述IgG洗脱的方法为:①用1毫升0.1M甲酸溶液洗脱IgG-真空泵抽滤,收集洗脱液;②向收集板中加入170μL中和缓冲液,并用枪头混匀;③用锡箔纸将收集板盖好,放在震荡器轻微摇晃,避免交叉污染,直至检测样品浓度本文档来自技高网
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一种血浆或血清的IgG糖型检测批量前处理方法

【技术保护点】
一种从血浆或血清的IgG上批处理切除糖链和纯化的方法,步骤包括:(1)IgG提取:通过96孔Protein G提取板将血浆或血清IgG提取至2mL96孔收集板中,测定蛋白浓度后,取出250‑350μL IgG溶液或120‑180μg IgG于1.1mL 96孔深孔板中整板挥干;(2)IgG切糖:在深孔板中加入变性剂变性蛋白后调节溶液pH至8.0,加入糖苷酶或切糖酶进行切除糖链;(3)糖链标记:在挥干的深孔板中加入2‑AB标记溶液,65℃反应3小时,进行2‑AB标记;(4)标记后纯化:深孔板加入乙腈溶液,上清液转移至96孔糖链纯化板,除去多余的标记试剂,在深孔板中收集洗脱出的被标记糖链,整板挥干;其中,步骤2)中变性剂为SDS溶液,并在60℃变性反应10min,或变性剂为Igepal溶液,并在室温变性反应10分钟;以及加入的糖苷酶或切糖酶的质量g与蛋白质的质量g比约1:50~1:30;步骤3)中,每孔加入的标记溶液为0.5mg的2‑AB和1.2mg的氰基硼氢化钠,并且所述2‑AB和氰基硼氢化钠预先配制在含30%乙酸的DMSO溶液中;步骤4)中,去除多余标记试剂所用清洗液为96%的乙腈溶液,洗脱标记的糖链为超纯水。...

【技术特征摘要】
1.一种从血浆或血清的IgG上批处理切除糖链和纯化的方法,步骤包括:(1)IgG提取:通过96孔ProteinG提取板将血浆或血清IgG提取至2mL96孔收集板中,测定蛋白浓度后,取出250-350μLIgG溶液或120-180μgIgG于1.1mL96孔深孔板中整板挥干;(2)IgG切糖:在深孔板中加入变性剂变性蛋白后调节溶液pH至8.0,加入糖苷酶或切糖酶进行切除糖链;(3)糖链标记:在挥干的深孔板中加入2-AB标记溶液,65℃反应3小时,进行2-AB标记;(4)标记后纯化:深孔板加入乙腈溶液,上清液转移至96孔糖链纯化板,除去多余的标记试剂,在深孔板中收集洗脱出的被标记糖链,整板挥干;其中,步骤2)中变性剂为SDS溶液,并在60℃变性反应10min,或变性剂为Igepal溶液,并在室温变性反应10分钟;以及加入的糖苷酶或切糖酶的质量g与蛋白质的质量g比约1:50~1:30;步骤3)中,每孔加入的标记溶液为0.5mg的2-AB和1.2mg的氰基硼氢化钠,并且所述2-AB和氰基硼氢化钠预先配制在含30%乙酸的DMSO溶液中;步骤4)中,去除多余标记试剂所用清洗液为96%的乙腈溶液,洗脱标记的糖链为超纯水。2.权利要求1的方法,其中步骤1)中还包括IgG提取板前处理、IgG结合和清洗、IgG洗脱、IgG提取板再生和保护。3.权利要求2的方法,其中所述IgG提取板前处理方法为:①用2毫升超纯水清洗板子-真空泵抽滤,去除废液;②用2毫升1×PBS清洗板子-真空泵抽滤,去除废液;③用1毫升0.1M甲酸溶液清洗板子-真空泵抽滤,去除废液;④用2毫升10×PBS进行板子的中和-真空泵抽滤,去除废液;⑤用4毫升1×PBS平衡板子-真空泵抽滤,去除废液。4.权利要求2或3的方法,其中所述IgG结合和清洗方法为:用2毫升1×PBS清洗板子-真空泵抽滤,去除废液。再重复2次。5.权利要求2或3的方法,其中所述IgG洗脱的方法为:①用1毫升0.1M甲酸溶液洗脱IgG-真空泵抽滤,收集洗脱液;②向收集板中加入170μL中和缓冲液,并用枪头混匀;③用锡箔纸将收集板盖好,放在震荡器轻微摇晃,避免交叉污染,直至检测样品浓度。④在其他具体实施方案中,所述IgG提取板再生和保护的方法为:⑤用2毫升0....

【专利技术属性】
技术研发人员:黄亚娟马庆伟王嵬王友信王皓曲海霞
申请(专利权)人:北京毅新博创生物科技有限公司
类型:发明
国别省市:北京,11

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