生产低聚果糖的方法技术

本发明专利技术涉及一种生产低聚果糖的方法，包括以下步骤：采用连接肽连接果糖基转移酶和葡萄糖氧化酶，然后在宿主菌中进行融合表达，得到融合蛋白；将融合蛋白和过氧化氢酶加入蔗糖水溶液中混匀，进行催化反应，得到低聚果糖。本发明专利技术还提供了一种上述方法在制备低聚果糖中的应用。采用本发明专利技术的方法可以显著提高低聚果糖的纯度，对其工业化生产及应用具有重要意义。

Process for producing low fructose oligosaccharides

The invention relates to a method for production of fructooligosaccharides, which comprises the following steps: using linker fructosyltransferase and glucose oxidase, and expressed in the host bacteria, obtained fusion protein; fusion protein and catalase added mixed sucrose aqueous solution, the catalytic reaction, get fructooligosaccharides. The invention also provides an application of the said method in preparing low fructose oligosaccharides. By adopting the method of the invention, the purity of the low fructose oligosaccharide can be obviously improved, and has important significance for industrialized production and application.

【技术实现步骤摘要】
生产低聚果糖的方法
本专利技术涉及生物催化
，尤其涉及一种生产低聚果糖的方法。
技术介绍
低聚果糖(FOS)又称寡果糖或蔗果三糖族低聚糖，分子式为：G-F-Fn，n＝1～3(G为葡萄糖，F为果糖)。低聚果糖是蔗糖分子的果糖残基上通β-1-2糖苷键连接1～3个果糖基而形成的果糖寡聚体，包括蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖及其混合物。与传统糖类相比，新型低聚果糖可作为益生元，促进双歧杆菌的生长、减少有害菌。低聚果糖具有水溶性膳食纤维的功效，且无任何毒副作用。低聚果糖广泛存在于大麦、西红柿、黑麦等植物中，但其含量较少(<1％)，开发较难。利用微生物低聚果糖生产酶(果糖基转移酶)可得到高纯度、高产量的低聚果糖。果糖基转移酶是一种具有果糖基转移活性的酶，能作用于蔗糖催化获得蔗果三糖等低聚糖。在果糖转移酶研究方面，目前国内主要集中在野生菌筛选、性质测定等方面。目前通过果糖基转移酶催化蔗糖生产获得的低聚果糖纯度只有50-60％。其中，生产的低聚果糖中葡萄糖和果糖(1-3％)占25-38％，蔗糖占9-25％，而由于糖浆内杂有葡萄糖、蔗糖和少量果糖，影响了低聚果糖生理功能。大部份低聚果糖特有的生理功能是用高纯度的低聚果糖作实验而得出的结论，而纯度不高时影响其应用。如纯度为50％的低聚果糖浆，糖尿病患者食用后血糖会很快升高，空腹食用30mL，30min后血糖很快从4.20mmol/L至5.84mmol/L，而空腹食用纯度为93％的低聚果糖糖浆，30min后血糖波动很小，从4.12mmol/L至4.18mmol/L。果糖基转移酶催化底物蔗糖生成低聚果糖过程中，会产生葡萄糖，葡萄糖和底物蔗糖对于果糖基转移酶属于竞争性抑制的关系，这严重影响了低聚果糖的纯度。因此，开发高纯度低聚果糖的制备方法的对于高纯度低聚果糖的生产及应用具有重要意义。
技术实现思路
为解决上述技术问题，本专利技术的目的是提供一种生产低聚果糖的方法，采用本专利技术的方法所生产的低聚果糖，其纯度可高达90％左右，对其工业化生产及应用具有重要意义。在一方面，本专利技术提供了一种生产低聚果糖的方法，包括以下步骤：(1)采用连接肽连接果糖基转移酶和葡萄糖氧化酶，然后在宿主菌中进行融合表达，得到融合蛋白；(2)将步骤(1)得到的所述融合蛋白和过氧化氢酶加入蔗糖水溶液中混匀，进行催化反应，得到低聚果糖，其中，低聚果糖的纯度为70-90％。进一步地，在步骤(1)中，融合表达包括以下步骤：(S1)通过PCR获得葡萄糖氧化酶基因，在获得的葡萄糖氧化酶基因的基础上通过含有连接肽的引物扩增获得含有连接肽基因的葡萄糖氧化酶基因；(S2)通过PCR获得果糖基转移酶基因，在其基础上，采用含有连接肽的引物进行扩增获得含有连接肽基因的果糖基转移酶基因；(S3)将步骤(S1)和步骤(S2)获得的基因作为混合模板，扩增获得果糖基转移酶与葡萄糖氧化酶的融合基因片段GOD-Fru基因；(S4)用限制性内切酶双酶切质粒和GOD-Fru基因，连接、转化后获得重组质粒；限制性内切酶为EcoRI和NotI；质粒为pPIC9K；(S5)将重组质粒电转化宿主菌后进行发酵培养，然后在宿主菌中进行融合表达。进一步地，在步骤(1)中，连接肽由3-30个氨基酸构成。进一步地，氨基酸为甘氨酸(Gly)、丙氨酸(Ala)、丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)、脯氨酸(Pro)和谷氨酸(Glu)中的一种或几种。进一步地，连接肽的氨基酸序列Gly-Gly-Gly、Gly-Gly-Ala-Gly、Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly、Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser、Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Ala-Ala、Gly-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Ala-Ala、Gly-Gly-Thr-Ala-Gly-Ala-Gly-Ala-Ala、Gly-Ala-Thr-Gly-Thr-Ala-Glu-Gly-Pro-Ser、Gly-Ala-Ala-Gly-Ala-Thr-Gly-Thr-Ala-Glu-Gly-Pro-Ser-Gly-Ala-Thr或Gly-Gly-Thr-Ala-Gly-Ala-Gly-Ala-Ala-Gly-Ala-Thr-Gly-Thr-Ala-Glu-Gly-Pro-Ser-Gly-Ala-Thr-Gly-Thr-Ala-Glu-Gly-Pro-Ser。优选地，连接肽的氨基酸序列为Gly-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Ala-Ala。进一步地，在步骤(1)中，宿主菌为毕赤酵母(Pichiapastoris)、酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)或大肠杆菌(Escharichiacoli)。优选地，宿主菌为毕赤酵母(Pichiapastoris)或酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)。进一步地，在步骤(1)中，果糖基转移酶来源于黑曲霉(Aspergillusniger)、米曲霉(A.oryzae)、甜菜或菊粉。进一步地，在步骤(1)中，葡萄糖氧化酶来源于黑曲霉(Aspergillusniger)或拟青霉属。拟青霉属为Paecilomycesamagasakiense、P.funicullosum、P.canescens或P.pinophilum。进一步地，在步骤(2)中，过氧化氢酶来源于枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、黑曲霉(Aspergillusniger)或嗜热子囊菌(Thermoascusauraniacu)。进一步地，过氧化氢酶通过野生菌表达生产或通过表达宿主异源表达生产，表达宿主为B.subtilis或P.pastoris。进一步地，在步骤(2)中，反应体系中的过氧化氢酶的终浓度为100-2000U/mL。优选地，过氧化氢酶的终浓度为300-1000U/mL。进一步地，在步骤(2)中，蔗糖水溶液的浓度为20-800g/L。优选地，蔗糖水溶液的浓度为50-300g/L。进一步地，在步骤(2)中，在温度为20-65℃，pH为4.0-8.0的条件下反应1-40h。本专利技术将果糖基转移酶与葡萄糖氧化酶融合表达，并基于融合表达体添加过氧化氢酶的复合型酶催化生产高纯度低聚果糖。借由上述方案，本专利技术至少具有以下优点：(1)本专利技术提供的一种重组果糖基转移酶与葡萄糖氧化酶融合蛋白；(2)获得的果糖基转移酶与葡萄糖氧化酶融合蛋白可高效催化蔗糖生产高纯度低聚果糖；(3)融合蛋白与过氧化氢酶联合使用催化蔗糖生产低聚果糖，低聚果糖的纯度最高可达90％。上述说明仅是本专利技术技术方案的概述，为了能够更清楚了解本专利技术的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本专利技术的较佳实施例并配合附图详细说明如后。附图说明图1是本专利技术融合表达重组质粒构建示意图；图2图示了果糖基转移酶与葡萄糖氧化酶融合表达对低聚果糖纯度的影响；图3图示了添加过氧化氢酶对低聚果糖纯度的影响。具体实施方式下面结合附图和实施例，对本专利技术的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本专利技术，但不用来限制本专利技术的范围。实施例1果糖基转移酶与葡萄糖氧化酶融合表达图1是本专利技术融合表达重组质粒构建示意图，其具体构建过程本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种生产低聚果糖的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)采用连接肽连接果糖基转移酶和葡萄糖氧化酶，然后在宿主菌中进行融合表达，得到融合蛋白；(2)将步骤(1)得到的所述融合蛋白和过氧化氢酶加入蔗糖水溶液中混匀，进行催化反应，得到低聚果糖。

【技术特征摘要】
1.一种生产低聚果糖的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)采用连接肽连接果糖基转移酶和葡萄糖氧化酶，然后在宿主菌中进行融合表达，得到融合蛋白；(2)将步骤(1)得到的所述融合蛋白和过氧化氢酶加入蔗糖水溶液中混匀，进行催化反应，得到低聚果糖。2.根据权利要求1所述的生产低聚果糖的方法，其特征在于：在步骤(1)中，所述连接肽由3-30个氨基酸构成。3.根据权利要求2所述的生产低聚果糖的方法，其特征在于：氨基酸为甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、脯氨酸和谷氨酸中的一种或几种。4.根据权利要求1所述的生产低聚果糖的方法，其特征在于：在步骤(1)中，所述宿主菌为毕赤酵母、酿酒酵母、枯草芽孢杆菌或大肠杆菌。5.根据...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨海泉，马道程，王拂祥，陈献忠，沈微，许菲，郭文文，樊游，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32