一种经化学修饰后的漆酶与磷酸铜结合的花状生物催化剂的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种室温下在磷酸缓冲盐溶液（pbs)中利用二价铜离子无机盐水溶液和酸酐修饰后的漆酶合成具有花状结构的生物催化剂及其制备方法。该催化剂的制备是由二价铜离子无机盐水溶液和酸酐修饰后的漆酶在磷酸缓冲盐溶液中反应，生成类似花状结构的生物催化材料。其制备包括以下步骤：将适量的二价铜盐溶液与经化学修饰过的漆酶溶液在磷酸缓冲盐溶液（pbs）中混合，充分反应，经离心、干燥得到花状生物催化剂。天然的漆酶由于表面积有限，且稳定性较低限制了其反应速率以及在催化工业中的应用。本发明专利技术形成的花状生物催化材料在很大程度上增加了漆酶的比表面积以及大大提高了稳定性和催化活性，提高了漆酶在催化工业中的应用潜能。

Method for preparing flower shaped biological catalyst combined with chemically modified laccase and cupric phosphate

The present invention discloses a biological catalyst with flower like structure synthesized by using two valence copper ion, inorganic salt solution and anhydride modified laccase in phosphoric acid buffered salt solution (PBS) at room temperature and preparation method thereof. The catalyst is prepared by reaction of two valence copper ion, inorganic salt solution and anhydride modified laccase in phosphate buffer salt solution to produce a biological catalytic material similar to flower like structure. The preparation method includes the following steps: two valent copper salt solution and the amount of chemically modified laccase solution in phosphate buffer solution (PBS) in the mixed reaction fully by centrifugation, dried flower biological catalyst. Because of its limited surface area and low stability, natural laccase restricts its reaction rate and its application in catalysis industry. The flower shaped biological catalytic material formed by the invention greatly increases the specific surface area of laccase, greatly improves the stability and catalytic activity, and improves the application potential of laccase in the catalytic industry.

【技术实现步骤摘要】
一种经化学修饰后的漆酶与磷酸铜结合的花状生物催化剂的制备方法
本专利技术涉及一种室温下由经化学修饰后漆酶与二价铜离子无机盐水溶液在适当pH的磷酸缓冲盐溶液（pbs）中结合成花状生物催化剂的制备方法，属用酶催化领域。
技术介绍
漆酶最早发现于漆树的汁液中，广泛存在于植物、真菌和细菌中，不同来源的漆酶，氧化能力不一样，其分子质量也相差很大。漆酶是一类多铜氧化还原酶，可以催化氧化多酚类化合物、胺类化合物以及氨基苯酚类化合物等和部分无机离子。由于漆酶的催化氧化反应只需空气中的氧气，副产物只有水，被称为“绿色催化剂”。由于漆酶具有化学试剂所没有的一些独特性质，其在食品工业、化学分析、医学、环保、造纸工业等方面都有很好的应用潜能。但由于天然漆酶表面积有限，使得反应速率有限，稳定性差，所以限制了其在工业中的应用。因此，有必要对其进行适当修饰，增加漆酶的表面积，提高稳定性和催化活性，以致于实现工业化。天然漆酶一般含有4个铜离子，分布于3个不同的高度保守的结合位点，每个铜原子在催化机制中都能发挥很重要的作用。漆酶能催化氧化，通过4个电子还原成水，同时伴随着一些酚类底物的氧化。漆酶是单电子氧化还原酶，它催化不同类型的底物进行氧化反应的机制是通过一种产生自由基的单电子反应，主要表现在底物自由基的生成和漆酶分子中4个铜离子的协同作用。漆酶催化底物氧化反应是通过以下3个主要步骤：（1）I型Cu2+从还原型底物接受电子被还原；（2）电子被传递到Ⅱ型Cu2+和Ⅲ型Cu2+形成T2/T3结构域的三核中心；（3）分子氧被激活并在T2/T3三核结构域被还原成水。然而，漆酶自然态中间体也可缓慢地转变成完全氧化的“休眠”漆酶，这种“休眠”漆酶具有从三核结构域中分离出来的游离Ⅱ型Cu2+。自然态中间体只有在还原剂缺乏的情况下才会发生向休眠态的转变，休眠态的Ⅰ型Cu2+位点能够被底物还原，而其三核结构域上的电子传递速率很慢以至于对整个催化过程的贡献不显著。因此，在大量的文献中提到对漆酶进行适当改性，主要有固定化和化学修饰两种方法，早期的文献中曾使用二价铜离子盐水溶液直接对漆酶进行修饰，形成了花状结构，对漆酶活性和稳定性有一定程度提升。为了进一步的提高漆酶活性和稳定性，在本专利中，我们首次采用先在磷酸缓冲盐溶液（pbs）中利用酸酐对天然漆酶进行适当化学修饰，提高其稳定性；然后再结合二价铜离子无机盐水溶液，由于二价铜盐是进行催化氧化有效的变价离子催化剂，使经化学修饰后漆酶与铜离子通过配位作用结合，形成花状结构的固定化酶材料；由于铜离子可参与漆酶活性中心的构建，共同构成漆酶结构中最重要的部分，决定漆酶活性的特异性，因此，能够提高酶活性。此外，这种花状多孔材料，孔大且比表面积高，传质速度快，有利于酶与底物的反应，修饰后漆酶的稳定性得到了进一步提升，采用本方法制备的经化学修饰后漆酶与磷酸铜结合的多孔生物催化剂具有更好的性能。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种经化学修饰后漆酶与二价铜离子无机盐水溶液结合成花状结构的生物催化剂的制备方法，所形成的生物催化剂具有花状结构，增加了漆酶的比表面积，大大提高了漆酶稳定性和催化活性。为达到上述目的，本专利技术首次提供了一种利用经化学修饰后漆酶与二价铜离子无机盐水溶液在适当pH的磷酸缓冲盐溶液中结合制备花状结构的生物催化剂的方法，其包括以下步骤：（1）首先，将漆酶进行化学修饰，取一定量适当pH的磷酸缓冲盐溶液（pbs），然后加入适量一定浓度的漆酶，再加入适量一定浓度的酸酐对漆酶进行化学修饰，反应一段时间后，将该反应混合物在适当pH的磷酸缓冲盐溶液（pbs）中透析一段时间，得到酸酐修饰后的漆酶溶液；（2）向（1）所述的经酸酐修饰后的漆酶溶液中，加入适量一定浓度的二价铜离子无机盐水溶液，快速混合，反应一段时间后，经离心、干燥得到固体粉末，即为经化学修饰后漆酶与磷酸铜结合的花状生物催化剂。在上述的经化学修饰后漆酶与磷酸铜结合的花状生物催化剂制备方法中，优选地，选用的磷酸缓冲盐溶液pH为7.2~7.4之间。在上述的经化学修饰后漆酶与磷酸铜结合的花状生物催化剂制备方法中，优选地，透析试剂为邻苯二甲酸酐、丁二酸酐、醋酸酐中的一种。在上述的经化学修饰后漆酶与磷酸铜结合的花状生物催化剂制备方法中，优选地，酸酐溶液浓度为0.1~0.5mol/L；漆酶溶液浓度为0.02~1.0mg/mL，透析时间3~24h。在上述的经化学修饰后漆酶与磷酸铜结合的花状生物催化剂制备方法中，优选地，所采用的二价铜盐可以为硝酸铜水溶液，硫酸铜水溶液，氯化铜水溶液的一种。在上述的经化学修饰后漆酶与磷酸铜结合的花状生物催化剂制备方法中，优选地，二价铜盐浓度为0.1~0.2mol/L，反应时间为3~6h。有益效果：本专利技术利用经化学修饰后漆酶与磷酸铜合成的花状生物催化剂，具有花状结构，很大程度上增加了漆酶的比表面积，进一步有利于提高催化活性和稳定性。附图说明图1是实施例1中制备的花状生物催化剂的扫描电镜图；图2是实施例2中制备的花状生物催化剂的扫描电镜图。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术作进一步的说明，但不能理解为对本专利技术的可实施范围的限定。实施例1取3mL磷酸缓冲盐溶液（pbs）（pH=7.2~7.4）于烧杯中，然后加入体积1mL浓度为0.2mg/mL漆酶溶液，然后加入体积150uL浓度为0.1mol/L邻苯二甲酸酐溶液，然后在pH为7.4的磷酸缓冲盐溶液中透析过夜；然后加入体积150uL浓度为0.12mol/L硫酸铜溶液，反应24h后，利用高速离心机5000r/min离心1min后干燥得到经化学修饰后漆酶与磷酸铜结合成的花状生物催化剂。实施例2取3mL磷酸缓冲盐溶液（pbs）（pH=7.2~7.4）于烧杯中，然后加入体积1mL浓度为0.5mg/mL漆酶溶液，然后加入体积150uL浓度为0.5mol/L邻苯二甲酸酐溶液，然后在pH为7.4的磷酸缓冲盐溶液中透析6h；然后加入体积150uL浓度为0.12mol/L硫酸铜溶液，反应2h后，利用高速离心机5000r/min离心30s后干燥得到经化学修饰后漆酶与磷酸铜结合成的花状生物催化剂。实施例3取3mL磷酸缓冲盐溶液（pbs）（pH=7.2~7.4）于烧杯中，然后加入体积1mL浓度为0.2mg/mL漆酶溶液，然后加入体积150uL浓度为0.1mol/L邻苯二甲酸酐溶液，然后在pH为7.4的磷酸缓冲盐溶液中透析6h；然后加入体积150uL浓度为0.12mol/L硫酸铜溶液，反应3h后，利用高速离心机5000r/min离心1min后干燥得到经化学修饰后漆酶与磷酸铜结合成的花状生物催化剂。实施例4取3mL磷酸缓冲盐溶液（pbs）（pH=7.2~7.4）于烧杯中，然后加入体积1mL浓度为1.0mg/mL漆酶溶液，然后加入体积150uL浓度为0.5mol/L邻苯二甲酸酐溶液，然后在pH为7.4的磷酸缓冲盐溶液中透析过夜；然后加入体积150uL浓度为0.12mol/L硫酸铜溶液，反应3h后，利用高速离心机5000r/min离心1min后干燥得到经化学修饰后漆酶与磷酸铜结合成的花状生物催化剂。本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种经化学修饰后的漆酶与磷酸铜结合的花状生物催化剂的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：（1）首先，将漆酶进行化学修饰，取一定量适当pH的磷酸缓冲盐溶液（pbs），然后加入适量一定浓度的漆酶，再加入适量一定浓度的酸酐对漆酶进行化学修饰，反应一段时间后，将该反应混合物在适当pH的磷酸缓冲盐溶液（pbs）中透析一段时间，得到酸酐修饰后的漆酶溶液；（2）向（1）所述的经酸酐修饰后漆酶溶液中，加入适量一定浓度的二价铜离子无机盐水溶液，快速混合，反应一段时间后，经离心、干燥得到固体粉末，即为经化学修饰后的漆酶与磷酸铜结合的花状生物催化剂。

【技术特征摘要】
1.一种经化学修饰后的漆酶与磷酸铜结合的花状生物催化剂的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：（1）首先，将漆酶进行化学修饰，取一定量适当pH的磷酸缓冲盐溶液（pbs），然后加入适量一定浓度的漆酶，再加入适量一定浓度的酸酐对漆酶进行化学修饰，反应一段时间后，将该反应混合物在适当pH的磷酸缓冲盐溶液（pbs）中透析一段时间，得到酸酐修饰后的漆酶溶液；（2）向（1）所述的经酸酐修饰后漆酶溶液中，加入适量一定浓度的二价铜离子无机盐水溶液，快速混合，反应一段时间后，经离心、干燥得到固体粉末，即为经化学修饰后的漆酶与磷酸铜结合的花状生物催化剂。2.根据权利要求1所述的经化学修饰后漆酶与磷酸铜结合的花状生物催化剂制备方法，其特征在于，选用的磷酸缓冲盐溶液（pbs）的pH为7.2~...

【专利技术属性】
技术研发人员：雷建都，朱蓬勃，何静，
申请(专利权)人：北京林业大学，
类型：发明
国别省市：北京,11