稳定的反应混合物制造技术

本发明专利技术提供了稳定的干燥的反应混合物、它们的制备方法、它们的使用方法和包含它们的试剂盒。所述稳定的干燥的反应混合物在许多重组DNA技术、特别是通过聚合酶链式反应(PCR)进行的核酸扩增中是有用的。

A stable reaction mixture

The present invention provides a stable, dry reaction mixture, a process for their preparation, a method for their use, and a kit containing them. The stable, dry reaction mixture is useful in many recombinant DNA technologies, especially in nucleic acid amplification by polymerase chain reaction (PCR).

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】稳定的反应混合物
本专利技术提供了稳定的反应混合物、它们的制备方法、它们的使用方法和包含它们的试剂盒。所述稳定的反应混合物在许多重组DNA技术、特别是通过聚合酶链式反应(PCR)进行的核酸扩增中是有用的。
技术介绍
为了解决生产稳定的多肽组合物的挑战，通常以固体形式制备蛋白质来提供可接受的贮存期限。一种用于制备固体形式蛋白质组合物的标准方法是冷冻干燥(冻干)，但是该方法会产生应激，所述应激可以使蛋白质在不同程度上变性(Wang,W.(2000)InternationalJournalofPharmaceutics203;1-60)。很少有生物反应化合物会以溶解形式稳定任何时间长度，且这对于室温贮存而言是特别真实的。结果，已经执行众多研究来评价增强处于干燥形式的生物反应化合物的贮存能力的可能性。普遍接受的是，为了确保例如聚合酶在再溶解以后的生物活性，必须使用至少一种稳定性添加剂。WO2008/36544描述了为了提供干燥的组合物的所谓的填充材料的应用，所述填充材料是例如碳水化合物诸如聚蔗糖、蔗糖、葡萄糖、海藻糖、松三糖、葡聚糖或甘露醇，蛋白质诸如BSA、明胶或胶原，和聚合物诸如PEG或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。在美国专利号5,098,893、5,200,399和5,240,843中进一步描述了用于稳定生物试剂的形成玻璃的填充材料。填充材料聚蔗糖是在美国专利号3,300,474中公开的共聚物。干燥液体反应混合物的方法在大多数情况下在性质上是非常复杂的，且因此，干燥程序是严苛的和昂贵的。冻干(美国专利号5,593,824)或真空干燥(美国专利号5,565,318)被用于干燥在碳水化合物聚合物基质中的生物学材料。冷冻干燥或冻干是充分确立的用于贮存蛋白质的技术，其被公开在许多现有技术文件中(例如Passot,S.,等人,PharmaceuticalDevelopmentandTechnology12(2007)543-553;Carpenter,J.F.,等人,PharmaceuticalResearch14(8)(1997)969-975;Schwegman,J.J.,等人,PharmaceuticalDevelopmentandTechnology10(2005)151-173)。在美国专利号7,407,747中描述了不同反应混合物的干燥条件的选择，所述反应混合物用于包含Taq聚合酶的遗传修饰的测序应用。使用的干燥程序是冻干、没有额外热的真空离心蒸发（speedvac）、具有额外热的真空离心蒸发和在室温风干。关于多种冷冻保护剂诸如海藻糖、蔗糖、葡萄糖和三甲胺-N-氧化物(TMANO)，测试了在该专利内的反应混合物。此外，还在根本没有冷冻保护剂的情况下执行实验，但是没有公开关于那些反应混合物随时间的稳定性的数据。仅对于包含海藻糖和牛血清白蛋白质(BSA)的反应混合物报道了长达8周的良好稳定性。此外，美国专利号7,407,747公开了使用在不同测序混合物中的聚合酶的实验，其中每种测序混合物包含缓冲溶液、核苷酸三磷酸、以及具有荧光标记和引物的核苷酸的不同组合物。但是，没有公开是否可以在不影响聚合酶的PCR活性的情况下干燥和储存用于实时PCR扩增的混合物（即包含缓冲溶液、核苷酸三磷酸、引物和检测探针的混合物）中的聚合酶。美国专利号8,652,811公开了一种干燥在实时PCR混合物内的TaqDNA聚合酶的方法，而得到的干燥的组合物可以在不影响耐热性DNA聚合酶的PCR性能的情况下储存。专利技术概述本专利技术提供了用于通过PCR和RT-PCR(逆转录酶-PCR)进行核酸扩增的稳定的反应混合物，其包含在不需要冷冻干燥或冻干下已经干燥的糖(例如，蔗糖)。本专利技术也提供了用于制备干燥的反应混合物的方法。因此，在一个方面，本专利技术涉及一种干燥的反应混合物组合物，其包含至少一种核酸扩增相关酶、核苷单体和糖，其中所述组合物是非冷冻干燥的。在某些实施方案中，所述组合物与(i)冷冻干燥的和/或(ii)缺少糖的反应混合物相比具有改善的稳定性。在某些实施方案中，所述糖选自蔗糖、海藻糖、右旋糖、乳糖、麦芽糖、海藻糖、环糊精、麦芽糊精和葡聚糖。在某些实施方案中，所述组合物还包含醋酸锰(Mn(OAc)2)。在某些实施方案中，所述组合物在或等同于在45℃保持3个月的条件下贮存后保留活性。在某些实施方案中，所述组合物还包含至少一种选自适体、去污剂、缓冲剂、盐和寡核苷酸的组分。在某些实施方案中，所述至少一种核酸扩增相关酶是选自以下的热稳定的聚合酶：水生栖热菌（Thermusaquaticus）TaqDNA聚合酶、栖热菌属（Thermussp.）Z05聚合酶、黄栖热菌（Thermusflavus）聚合酶、海栖热袍菌（Thermotogamaritima）聚合酶、那不勒斯栖热袍菌（Thermotoganeapolitana）聚合酶、TMA-25聚合酶、TMA-30聚合酶、TthDNA聚合酶、以及经修饰的热稳定的聚合酶或它们的任意组合。在某些实施方案中，所述糖以一定量存在，使得如果在水溶液中重构所述组合物，所述糖的浓度是在约50mM至约1000mM之间。在某些实施方案中，所述糖是蔗糖。在某些实施方案中，所述组合物在或等同于在环境温度保持12个月的条件下贮存后保留活性。在另一个方面，本专利技术涉及一种制备干燥的反应混合物组合物的方法，所述方法包括：在没有冷冻干燥存在下干燥含水形式的反应混合物，其中所述含水形式的反应混合物包含至少一种核酸扩增相关酶、核苷单体和糖。在某些实施方案中，所述糖选自蔗糖、海藻糖、右旋糖、乳糖、麦芽糖、海藻糖、环糊精、麦芽糊精和葡聚糖。在某些实施方案中，所述组合物在或等同于在45℃保持3个月的条件下贮存后保留活性。在某些实施方案中，在环境温度执行所述方法。在某些实施方案中，所述糖在含水形式的反应混合物中是在约50mM至约1000mM之间的浓度。在某些实施方案中，所述糖是蔗糖。在某些实施方案中，所述至少一种核酸扩增相关酶是选自以下的热稳定的聚合酶：水生栖热菌TaqDNA聚合酶、栖热菌属Z05聚合酶、黄栖热菌聚合酶、海栖热袍菌聚合酶、那不勒斯栖热袍菌聚合酶、TMA-25聚合酶、TMA-30聚合酶、TthDNA聚合酶、以及经修饰的热稳定的聚合酶或它们的任意组合。在某些实施方案中，所述组合物在或等同于在环境温度保持12个月的条件下贮存后保留活性。在专利技术详述中和在附图中更详细地描述了本专利技术的实施方案和优点。附图说明图1显示了在42℃贮存的第1天由冷冻干燥的(A)和非冷冻干燥的(B)干燥的反应主混合物产生的RT-PCR生长曲线。图2显示了在42℃贮存的第15天由冷冻干燥的(A)和非冷冻干燥的(B)干燥的反应主混合物产生的RT-PCR生长曲线。图3显示了在42℃贮存的第29天由冷冻干燥的(A)和非冷冻干燥的(B)干燥的反应主混合物产生的RT-PCR生长曲线。图4显示了在42℃贮存的第49天由冷冻干燥的(A)和非冷冻干燥的(B)干燥的反应主混合物产生的RT-PCR生长曲线。图5显示了在42℃贮存的第90天由非冷冻干燥的干燥的反应主混合物产生的RT-PCR生长曲线。图6显示了在环境温度贮存的第26天由非冷冻干燥的干燥的反应主混合物产生的RT-PCR生长曲线本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种干燥的反应混合物组合物，其包含至少一种核酸扩增相关酶、核苷酸三磷酸和糖，其中所述组合物是非冷冻干燥的。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.12.19 US 62/0942841.一种干燥的反应混合物组合物，其包含至少一种核酸扩增相关酶、核苷酸三磷酸和糖，其中所述组合物是非冷冻干燥的。2.根据权利要求1的组合物，所述组合物与(i)冷冻干燥的和/或(ii)缺少糖的反应混合物相比具有改善的稳定性。3.根据权利要求1或2中的任一项的组合物，其中所述糖选自蔗糖、海藻糖、右旋糖、乳糖、麦芽糖、海藻糖、环糊精、麦芽糊精和葡聚糖。4.根据权利要求1-3中的任一项的组合物，所述组合物还包含醋酸锰(Mn(OAc)2)。5.根据权利要求1-4中的任一项的组合物，其中所述组合物在或等同于在45℃保持3个月的条件下贮存后保留活性。6.根据权利要求1-5中的任一项的组合物，所述组合物还包含至少一种选自适体、去污剂、缓冲剂、盐和寡核苷酸的组分。7.根据权利要求1-6中的任一项的组合物，其中所述至少一种核酸扩增相关酶是选自以下的热稳定的聚合酶：水生栖热菌（Thermusaquaticus）TaqDNA聚合酶、栖热菌属（Thermussp.）Z05聚合酶、黄栖热菌（Thermusflavus）聚合酶、海栖热袍菌（Thermotogamaritima）聚合酶、那不勒斯栖热袍菌（Thermotoganeapolitana）聚合酶、TMA-25聚合酶、TMA-30聚合酶、TthDNA聚合酶、以及经修饰的热稳定的聚合酶或它们的任意组合。8.根据权利要求1-7中的任一项的组合物，其中所述糖以一定量存在，所述量使得如果在水溶液中重构所...

【专利技术属性】
技术研发人员：T马蒂内斯，E史密斯，
申请(专利权)人：豪夫迈·罗氏有限公司，
类型：发明
国别省市：瑞士,CH