猪结肠微生物组体外模拟培养的发酵参数制造技术

本发明专利技术公开了猪结肠微生物组体外模拟培养的发酵参数。本发明专利技术提供的发酵参数，包括用于体外模拟培养猪肠道微生物的培养基，该培养基包括溶质，所述溶质由牛肉浸粉、胰蛋白示、L‑半胱氨酸‑HCL、葡萄糖、酵母浸粉、氯化钠、可溶性淀粉和糖蜜组成。本发明专利技术的发酵参数还包括发酵液体体积330mL，pH＝6.4±0.1温度37±0.1℃，搅拌速度120rpm，补料和出料速度330mL/天，发酵天数12天，严格厌氧环境。本发明专利技术通过优化体外连续发酵培养模型的培养基，培养出与猪肠道较高相似度的微生物组，为猪肠道微生物的体外研究提供一个可靠有力的实用工具，对猪的生产和人类健康研究起到积极地推动作用。

Fermentation parameters of swine colon microbiota in vitro

The invention discloses fermentation parameters of pig colon microorganism group in vitro simulation culture. The fermentation parameters provided by the invention, including for the simulation of cultured pig intestinal microbial culture medium in vitro, the solute, the solute by beef powder, tryptose, L HCL, cysteine glucose, yeast extract powder, sodium chloride, soluble starch and sugar composition of honey. The fermentation parameters of the invention also include the fermentation liquid volume 330mL, pH = 6.4 + 0.1, temperature 37 + 0.1 DEG C, stirring speed 120rpm, feeding and discharging speed 330mL/ days, fermentation days 12 days, strict anaerobic environment. The invention of continuous fermentation medium model by optimization of in vitro cultured microbes group and intestinal tract high similarity, provide a reliable and practical tool for in vitro study of porcine intestinal microorganisms, production and human health research plays an active role in pigs.

【技术实现步骤摘要】
猪结肠微生物组体外模拟培养的发酵参数
本专利技术涉及生物技术和畜牧领域，尤其涉及一种猪结肠微生物组体外模拟培养的发酵参数，主要为培养基配方，还包括发酵液体体积、pH值、发酵时间、温度、搅拌速度、氧分压、补料和出料速度。
技术介绍
动物肠道中生活着大量的微生物，其数量和基因数都超过宿主(Baekhed等，2005；Qin等，2010)，并与宿主有着紧密联系。结肠中微生物在丰度、种类和功能上占主导地位。肠道微生物具有重要的营养、免疫、抗肿瘤和抗衰老等作用(王珊珊等，2015)，微生物不仅能发酵底物为宿主提供宿主所需能量的10％，合成维生素，促进营养物质的吸收；还能促进免疫器官的发育和免疫细胞的增殖分化，抑制病原菌在体内的增殖等。因此，肠道微生物被称为动物体的一个“新器官”(Hattori等，2009)。研究肠道微生物的功能和机制时，多采用动物或人体试验，通过收粪或屠宰采集肠道中微生物样品，但面临着成本高、操作复杂、粪便代表性低及潜在伦理等问题。此外，菌群移植技术不仅是治疗肠道疾病的有效手段，对艰难梭菌感染、炎性肠病、肠易综合征和克罗恩病等有较高治愈率，还能提高糖尿病患者胰岛敏感性(Bakke等，2011；Vermerire等，2012；Vrieze等，2012；Anderson等，2012)；接受菌群移植后的家畜还能表现出与供体动物比较一致的健康水平、饲料转化效率和肥胖状况等表型。但菌群移植的研究面临着供体筛选程序复杂、来源少、标准不统一、成本高及潜在的伦理问题等因素的制约，因此，急需一种技术手段代替动物试验研究肠道微生物的功能和机制、代替粪便提供大量稳定、成本低的肠道菌群用于菌群移植。体外连续发酵模拟培养是解决上述问题的有效手段。该系统能够模拟肠道的主要生理特征如pH值、流加速度、温度等，加上合适的培养基，理论上可以让微生物在发酵系统中与肠道内有相似的生长繁殖特性。因此，该系统可以代替动物试验在体外研究肠道微生物的功能和机制，并且能够生产出大量质量稳定的肠道菌群代替粪便中的菌群用于微生物移植，消除了上述存在的一系列制约因素。已有大量研究表明，单相连续发酵系统具有较高水平的稳定性，不同培养批次之间的微生物菌群结构相似度基本都在90％以上(陈波，2012；)，并且已经在部分食物原料和抗生素等药物对人体肠道微生物影响的研究方面取得了进展(郭卫革，2012；范彬，2016)。美国食品药品监督局也利用类似的体外系统作为新型的药物评价手段。甚至有研究人员将此系统用于筛选和生产益生菌，对动物生产性能有明显的促进作用(杨伟平，2015)。生产出的微生态制剂用于粪便移植，研究肠道微生物与宿主的相互作用(Yin等，2010)。培养基的配制是影响体外培养肠道微生物效果最重要的因素，也是决定体外培养系统可靠性的重要因素。营养供给直接决定了能够在体外生长增殖的细菌。此外，由于肠道微生物的种类多样性和代谢网路的复杂性，一种微生物的代谢产物可能影响着其他好多种微生物的生长增殖(Alain等，2009)。因此，培养基的配制也是最具有挑战性的技术难点。已有大量关于连续发酵培养系统稳定性和重复性的研究，及利用该系统评价各种饲料原料和药物对肠道微生物影响的研究，但对系统培养的微生物与肠道微生物之间的相似性研究却很少，造成体外模拟培养的微生物菌群结构与肠道实际情况有较大差异，试验结果可信度大打折扣，严重制约了体外培养系统研究肠道微生物的发展与应用。猪作为重要家畜，对人们生活水平和健康具有不可替代的作用。肠道微生物对猪的健康、营养利用及其肉品质有较大影响。同时，猪也是重要的模式动物，对人类医学研究也有重要的参考价值。结肠是猪肠道微生物聚集和发挥作用的主要部位，具有重要研究意义。动物体内，肠道微生物能够接触并利用的营养物质主要来源于饲料。除部分人工合成的氨基酸外，实际生产中天然饲料原料占主要组成部分。葡萄糖和可溶性淀粉作为快速水解糖类，只有很小一部分能够到达后肠段供大肠微生物利用。此外，动物自身分泌的消化酶无法消化的低聚糖和细胞壁保护的细胞内的糖也能进入大肠。大肠微生物种类丰富，利用的糖种类也复杂多样、且组成结构较为复杂。因此，葡萄糖和可溶性淀粉作为主要糖来源用于体外培养大肠微生物似乎并不能满足需求。猪饲料中的蛋白质主要为植物源，培养基中的胰蛋白示和牛肉浸粉均为动物源蛋白质，这可能是体外模拟培养的限制因素之一。消化道分泌的消化酶和其它分泌蛋白都能被微生物进一步利用。糖蜜(Molasses,MOL)是制糖工业的副产物，其主要组成为：干物质75％，全糖分46-52％，蔗糖28-32％，还原糖18-20％，非发酵糖类2-4％，非糖有机物9-12％，可溶性树胶及其他碳水化合物4％，还有少量的蛋白质、维生素和无机盐(Tate等，1979)。玉米浆(Cornsteepliquor，CSL)是湿磨法生产玉米可溶性淀粉时的副产物，主要组成为：干物质40-50％，粗蛋白质16-30％，氨基酸8-12％，还原糖5-7％，维生素0.7-1mg/L总酸8-13％，乳酸7-12％，磷4-4.5％，钾2-2.5％(李海燕，2013)。糖蜜和玉米浆被广泛的应用抗生素、氨基酸、酶制剂等发酵工业中(左莹等，2013)。目前没有比较完善的针对猪结肠微生物组的体外模拟培养参数，从针对人或动物的培养体系照搬过来使用，效果较差，微生物组相似性较低，导致体外模型研究猪肠道微生物可靠性较差。
技术实现思路
解决猪结肠微生物组体外模拟培养效果较差的问题，使模拟培养的肠道微生物组与结肠微生物组相似度达到一个较高水平，使体外发酵模拟培养系统代替动物试验研究猪结肠道微生物更加可靠、可信。本专利技术的一个目的是提供一套高效的、可靠的、用于体外模拟培养猪结肠微生物的发酵参数，特别是培养基。本专利技术提供的培养基，包括溶质，所述溶质由牛肉浸粉、胰蛋白示、L-半胱氨酸-HCL、葡萄糖、酵母浸粉、氯化钠、可溶性淀粉和糖蜜组成。牛肉浸粉，北京奥博星生物技术有限责任公司，01-008A；酵母浸粉，北京奥博星生物技术有限责任公司，01-012；可溶性淀粉(来源于玉米)，北京索莱宝科技有限公司，G8300；L-半胱氨酸-HCL(L－Cysteine-HCL)，北京索莱宝科技有限公司，C0011；糖蜜，北京索莱宝科技有限公司，FA0070；胰蛋白示，Oxiod；葡萄糖，国药，40165664；氯化钠，国药，10019308；上述培养基中，所述牛肉浸粉、所述胰蛋白示、所述L-半胱氨酸-HCL、所述葡萄糖、所述酵母浸粉、所述氯化钠、所述可溶性淀粉和所述糖蜜的质量比为2-5：20：0.5-1：2-3：5：5：1：5；或所述牛肉浸粉、所述胰蛋白示、所述L-半胱氨酸-HCL、所述葡萄糖、所述酵母浸粉、所述氯化钠、所述可溶性淀粉和所述糖蜜的质量比为2.4：20：0.6：2.5：5：5：1：5。本专利技术提供的发酵参数，包括发酵液体体积330mL，pH＝6.4±0.1温度37±0.1℃，搅拌速度120rpm，补料和出料速度330mL/天，发酵天数12天，严格厌氧环境，发酵时间：①未开启进出料的闷罐发酵时间16h，②开启进出料的连续发酵时间8-14d。上述可溶性淀粉为玉米可溶性淀粉(来源于玉米)。上述培养基中，所述牛肉浸粉在所述培养基中的浓本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于体外模拟培养猪肠道微生物的培养基，包括溶质，所述溶质由牛肉浸粉、胰蛋白示、L‑半胱氨酸‑HCL、葡萄糖、酵母浸粉、氯化钠、可溶性淀粉和糖蜜组成。

【技术特征摘要】
1.一种用于体外模拟培养猪肠道微生物的培养基，包括溶质，所述溶质由牛肉浸粉、胰蛋白示、L-半胱氨酸-HCL、葡萄糖、酵母浸粉、氯化钠、可溶性淀粉和糖蜜组成。2.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于：所述牛肉浸粉、所述胰蛋白示、所述L-半胱氨酸-HCL、所述葡萄糖、所述酵母浸粉、所述氯化钠、所述可溶性淀粉和所述糖蜜的质量比为2-5：20：0.5-1：2-3：5：5：1：5；或所述牛肉浸粉、所述胰蛋白示、所述L-半胱氨酸-HCL、所述葡萄糖、所述酵母浸粉、所述氯化钠、所述可溶性淀粉和所述糖蜜的质量比为2.4：20：0.6：2.5：5：5：1：5。3.根据权利要求1或2所述的培养基，其特征在于：所述牛肉浸粉在所述培养基中的浓度为2.4g/L；所述胰蛋白示在所述培养基中的浓度为20g/L；所述L-半胱氨酸-HCL在所述培养基中的浓度为0.6g/L；所述葡萄糖在所述培养基中的浓度为2.5g/L；所述酵母浸粉在所述培养基中的浓度为5g/L；所述氯化钠在所述培养基中的浓度为5g/L；所述可溶性淀粉在所述培养基中的浓度为1g/L；所述糖蜜在所述培养基中的浓度为5g/L。4.根据权利要求1-3中任一所述的培养基，其特征在于：所述培养基还包括溶剂，所述培养基由溶质和...

【专利技术属性】
技术研发人员：王军军，颜桥，杨鹏，何贝贝，李娜，李天天，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：北京,11