使用岩藻糖类似物在体内抑制蛋白质岩藻糖基化的方法技术

本发明专利技术提供通过给予岩藻糖类似物在体内抑制蛋白质包括抗体的岩藻糖基化的方法与组合物。

Method for inhibiting protein glycosylation in vivo by using fucose analogues

The present invention provides methods and compositions for inhibiting protein glycosylation in vivo, including antibodies, by giving fucose analogs.

【技术实现步骤摘要】
相关申请的交叉引用本申请要求于2010年8月5日提交的美国临时专利申请号61/371,116，的优先权，该临时申请的公开内容通过引用纳入本文。
技术介绍
L-岩藻糖是一种单糖，又名6-脱氧-L-半乳糖，是动物中的一些N-连接型与O-连接型多聚糖与糖脂的组分。(见Becker与Lowe，Glycobiology13:41R-51R(2003).)岩藻糖通常作为末端修饰添加至多聚糖，包括血型抗原，选择素与抗体所接多聚糖。岩藻糖可以通过特异性岩藻糖基转移酶经α(1,2)-、α(1,3)-、α(1,4)-与α(1,6)-连接结合到多聚糖上。α(1,2)-岩藻糖连接通常与H血型抗原相关联。α(1,3)-与α(1,4)-岩藻糖连接与LewisX抗原的修饰相关联。α(1,6)-岩藻糖连接与N-连接的N-乙酰葡萄糖胺(GlcNac)分子如在抗体中的那些分子相关联。据信蛋白质的岩藻糖基化在哺乳动物的发育过程中发挥作用。将FX基因靶向突变的小鼠纯合子表现出多种异常，包括致死表型。也报道过小鼠自杂合体杂交种的恢复减弱。(Becker等人，MammalianGenome14：130-139(2003))。已提出异常的蛋白质岩藻糖基化与人类疾病相关联，包括在癌症中的唾液酸化LewisX与唾液酸化Lewisy的上调。这些多聚糖是E-型和P-型选择素分子的配体。据推测癌细胞上唾液酸化LewisX与唾液酸化Lewisy多聚糖的提高通过与内皮上的E-型和P-型选择素的相互作用来促进转移。在风湿性关节炎的患者中也观察到岩藻糖基化多聚糖增多。然而，目前还没有已批准的针对蛋白岩藻糖基化水平的治疗手段。
技术实现思路
本文所述方法和组合物部分基于实施例中所示的出乎意料的结果，显示出施用岩藻糖类似物的动物中蛋白质岩藻糖基化减少。抗体与其他蛋白质的岩藻糖基化可以使用本文所述的岩藻糖类似物来调节。一方面，本专利技术提供在体内产生去岩藻糖基化蛋白质的方法和组合物。施用产岩藻糖类似物(如化学式Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ，Ⅴ或Ⅵ)的蛋白质如细胞表面蛋白质于动物如哺乳动物，该动物的岩藻糖基化降低。岩藻糖基化的降低分别相对于未经具有化学式Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ，Ⅴ或Ⅵ的岩藻糖类似物处理的动物而言。在一相关方面，本专利技术提供在体内产生核心岩藻糖基化降低的抗体和抗体衍生物的方法和组合物。施用岩藻糖类似物(如化学式Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ，Ⅴ或Ⅵ)于动物，该动物产生出核心岩藻糖基化降低的抗体和抗体衍生物(即，N-糖苷连接型复合糖链的N-乙酰葡萄糖胺的岩藻糖基化降低，所述糖链通过糖链还原性末端的N-乙酰葡萄糖胺结合于Fc区)。核心岩藻糖基化的降低分别相对于未经具有化学式Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ，Ⅴ或Ⅵ的岩藻糖类似物处理的动物而言。另一方面，本专利技术提供包含岩藻糖类似物并配制供施用于目标动物的药物组合物。所述岩藻糖类似物可以配制供施用于目标动物以在体内抑制或降低岩藻糖基化。本专利技术的上述与其他方面可通过参考以下详细叙述、具体实施方式的非限制性实施例和附图得以更全面地理解。附图简要说明图1显示使用施用岩藻糖类似物(通过腹腔注射)对抗体岩藻糖基化的影响。左图显示斑点印迹图而右图显示坐标图。斑点印迹蛋白点样水平(左上图)与岩藻糖特异性生物发光(左下图)显示抗体cAC10标准(下方的斑点印迹最左侧虚线框与上方斑点印迹的对应列)，未经处理的对照(下方的斑点印迹左起第二个虚线框与上方斑点印迹的对应列)，以及炔基岩藻糖(SGD-1887；下方的斑点印迹居中的虚线框长方形与上方斑点印迹的对应列)，过乙酸炔基岩藻糖(SGD-1890；下方的斑点印迹右起第二个虚线框与上方斑点印迹的对应列)，以及2-氟岩藻糖(SGD-2083；下方的斑点印迹最右侧的虚线框与上方斑点印迹的对应列)。在校正点样水平后，岩藻糖基化的百分率显示在右侧坐标图中。图2显示通过饮用水给予岩藻糖类似物对于抗体核心岩藻糖基化的影响。坐标图显示由气相色谱(GC)测定的抗体岩藻糖基化的百分率：图A与B显示分离自处理组的抗KLH-抗体(Ab)的岩藻糖基化水平，而图C与D则显示其余IgG抗体(非-KLH-特异性)的岩藻糖基化的水平。图A与C显示使用纯化抗体的标准曲线(0-100％岩藻糖基化)确定的各动物的岩藻糖基化百分率。图B与D以相对未经处理的对照组均值的百分率显示处理组的岩藻糖基化水平。图3显示通过饮用水给予岩藻糖类似物对于抗体核心岩藻糖基化的影响。图中显示非-KLH-特异性抗体的岩藻糖基化水平。显示蛋白点样水平(左上图)与岩藻糖特异性生物发光(左下图)的斑点印迹，分别为抗体cAC10标准(上方与下方的斑点印迹，最左侧框)，未经处理的对照组(上方与下方的斑点印迹，左起第二个(上方)及右侧框)，以及2-氟岩藻糖(上方与下方的斑点印迹，左起第二个(下方)以及右起第二个框(上方与下方的))。在校正点样水平后，岩藻糖化的百分率显示在右侧坐标图中。图4显示通过饮用水给予不同剂量2-氟岩藻糖对抗体核心岩藻糖基化的影响。斑点印迹显示蛋白点样水平(左)与岩藻糖特异性生物发光(中)，分别是未经处理的对照组和1，10，与100毫摩尔SGD-2083(如图所示)。与未经处理组相比的岩藻糖化的百分率显示在右侧坐标图中。图5显示给予2-氟岩藻糖对循环白细胞与嗜中性粒细胞的影响。图A，从个体小鼠采集血样，在血细胞计数器上使用Turk溶液排除红细胞来计数确定白细胞数。图B，为确定嗜中性粒细胞数，通过流式细胞术来测定Gr-1+的白细胞百分率，并用于(A)中测定的细胞总数。图C，从个体小鼠采集了淋巴结库，制备单细胞悬液，并用血细胞计数器计数。符号代表个体小鼠(每组n＝3；菱形，未经处理；方形，1毫摩尔2-氟岩藻糖(SGD-2083)；三角形，10毫摩尔2-氟岩藻糖；圆形，100毫摩尔2-氟岩藻糖)。图6显示给予2-氟岩藻糖对于E-选择素结合嗜中性粒细胞的影响。图A，使用流式细胞术鉴定嗜中性粒细胞的示例。细胞根据前向角散射和侧向角散射来门控以纳入活的白细胞，然后将结果用描述Gr-1染色的直方图表示以鉴定嗜中性粒细胞。门控选出阳性细胞，确定阳性细胞的百分比(用于图5B中的细胞计数)，此门控应用于(B)的直方图中。图B，E-选择素结合来自未经处理的动物(左)和口服给予100毫摩尔2-氟岩藻糖(SGD-2803)的动物(右)的嗜中性粒细胞的示例。灰色的直方图显示E-选择素的结合而虚线显示仅二级试剂的结合。针对E-选择素的结合测定荧光强度的几何平均值。图C，对(B)中各动物测定E-选择素结合的几何平均荧光强度，并在组间比较(每组n＝3；误差线表示标准差)。图7显示用某些岩藻糖类似物培养细胞系对蛋白质岩藻糖基化的影响。检测了细胞系LS174T，PC-3，Ramos，HL-60cy与Caki-1。图8显示给予岩藻糖类似物对小鼠肿瘤异种移植模型的影响。图A-E分别显示使用LS174T，PC-3，Ramos，HL-60cy与Caki-1细胞系(经过2-氟岩藻糖(SGD-2803)预处理)的小鼠肿瘤异种移植模型中的结果。图F显示使用未经处理LS174T细胞系的小鼠肿瘤异种移植模型中的结果。图9显示肿瘤疫苗模型的研究计划(图A)与结果(图B)，该模型基于使用灭活的A20鼠淋巴瘤细胞进行预免疫，然后在给予或不给予岩藻糖类似物(本文档来自技高网...

【技术保护点】
岩藻糖类似物在药物制备中的用途，所述药物用于抑制哺乳动物中的蛋白质岩藻糖基化，所述岩藻糖类似物选自以下分子式(V)或(VI)其中之一或其生物学可接受的盐或溶剂化物：其中化学式(V)或(VI)各自可以是α或β异头物或对应的醛糖形式；R1、R2、R2a、R3、R3a和R4各自独立地选自以下基团：‑OH、‑OC(O)H、‑OC(O)C1‑C10烷基、‑OC(O)C2‑C10烯基、‑OC(O)C2‑C10炔基、‑OC(O)芳基，‑OC(O)杂环、‑OC(O)C1‑C10亚烷基(芳基)、‑OC(O)C2‑C10亚烯基(芳基)、‑OC(O)C2‑C10亚炔基(芳基)、‑OC(O)C1‑C10亚烷基(杂环)、‑OC(O)C2‑C10亚烯基(杂环)、‑OC(O)C2‑C10亚炔基(杂环)、‑OCH2OC(O)烷基、‑OCH2OC(O)O烷基、‑OCH2OC(O)芳基、‑OCH2OC(O)O芳基、‑OC(O)CH2O(CH2CH2O)nCH3、‑OC(O)CH2CH2O(CH2CH2O)nCH3、‑O‑三‑C1‑C3烷基甲硅烷基、–OC1‑C10烷基和小的吸电子基团，其中各n是独立选自0‑5的整数；R5是选自下组的成员：–CH3、‑CHX2、‑CH2X、由卤素取代的或未取代的‑CH(X')‑C1‑C4烷基、由卤素取代的或未取代的‑CH(X')‑C2‑C4烯基、由卤素取代的或未取代的‑CH(X')‑C2‑C4炔基、‑CH＝C(R10)(R11)、‑C(CH3)＝C(R12)(R13)、‑C(R14)＝C＝C(R15)(R16)、由甲基或卤素取代的或未取代的‑C3碳环、由卤素或甲基取代的或未取代的‑CH(X')‑C3碳环、由卤素或甲基取代的或未取代的C3杂环、由卤素或甲基取代的或未取代的‑CH(X')‑C3杂环、‑CH2N3、‑CH2CH2N3和苄氧甲基，或R5是小的吸电子基团；其中R10是氢或被卤素取代或未取代的C1‑C3烷基；R11是被卤素取代的或未取代的C1‑C3烷基；R12是氢，卤素或被卤素取代的或未取代的C1‑C3烷基；以及R13是氢，或被卤素取代的或未取代的C1‑C3烷基；R14是氢或甲基；R15和R16独立地选自氢，甲基与卤素；X是卤素；以及X'是卤素或氢；以及另外，R1、R2、R2a、R3和R3a各自可选为氢；可选在邻近碳原子上的R1，R2，R2a，R3和R3a中的两个在上述邻近碳原子之间联合形成双键；以及前提是R1、R2、R2a、R3、R3a、R4、R5中至少一个为小的吸电子基团，或R5包含卤素，不饱和位点，碳环，杂环或叠氮化物，除非(i)R2与R2a均为氢，(ii)R3与R3a均为氢，(iii)R1为氢，(iv)在所述邻近碳原子之间存在双键，或(v)R5为苄氧甲基。...

【技术特征摘要】
2010.08.05 US 61/371,1161.岩藻糖类似物在药物制备中的用途，所述药物用于抑制哺乳动物中的蛋白质岩藻糖基化，所述岩藻糖类似物选自以下分子式(V)或(VI)其中之一或其生物学可接受的盐或溶剂化物：其中化学式(V)或(VI)各自可以是α或β异头物或对应的醛糖形式；R1、R2、R2a、R3、R3a和R4各自独立地选自以下基团：-OH、-OC(O)H、-OC(O)C1-C10烷基、-OC(O)C2-C10烯基、-OC(O)C2-C10炔基、-OC(O)芳基，-OC(O)杂环、-OC(O)C1-C10亚烷基(芳基)、-OC(O)C2-C10亚烯基(芳基)、-OC(O)C2-C10亚炔基(芳基)、-OC(O)C1-C10亚烷基(杂环)、-OC(O)C2-C10亚烯基(杂环)、-OC(O)C2-C10亚炔基(杂环)、-OCH2OC(O)烷基、-OCH2OC(O)O烷基、-OCH2OC(O)芳基、-OCH2OC(O)O芳基、-OC(O)CH2O(CH2CH2O)nCH3、-OC(O)CH2CH2O(CH2CH2O)nCH3、-O-三-C1-C3烷基甲硅烷基、–OC1-C10烷基和小的吸电子基团，其中各n是独立选自0-5的整数；R5是选自下组的成员：–CH3、-CHX2、-CH2X、由卤素取代的或未取代的-CH(X')-C1-C4烷基、由卤素取代的或未取代的-CH(X')-C2-C4烯基、由卤素取代的或未取代的-CH(X')-C2-C4炔基、-CH＝C(R10)(R11)、-C(CH3)＝C(R12)(R13)、-C(R14)＝C＝C(R15)(R16)、由甲基或卤素取代的或未取代的-C3碳环、由卤素或甲基取代的或未取代的-CH(X')-C3碳环、由卤素或甲基取代的或未取代的C3杂环、由卤素或甲基取代的或未取代的-CH(X')-C3杂环、-CH2N3、-CH2CH2N3和苄氧甲基，或R5是小的吸电子基团；其中R10是氢或被卤素取代或未取代的C1-C3烷基；R11是被卤素取代的或未取代的C1-C3烷基；R12是氢，卤素或被卤素取代的或未取代的C1-C3烷基；以及R13是氢，或被卤素取代的或未取代的C1-C3烷基；R14是氢或甲基；R15和R16独立地选自氢，甲基与卤素；X是卤素；以及X'是卤素或氢；以及另外，R1、R2、R2a、R3和R3a各自可选为氢；可选在邻近碳原子上的R1，R2，R2a，R3和R3a中的两个在上述邻近碳原子之间联合形成双键；以及前提是R1、R2、R2a、R3、R3a、R4、R5中至少一个为小的吸电子基团，或R5包含卤素，不饱和位点，碳环，杂环或叠氮化物，除非(i)R2与R2a均为氢，(ii)R3与R3a均为氢，(iii)R1为氢，(iv)在所述邻近碳原子之间存在双键，或(v)R5为苄氧甲基。2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述岩藻糖类似物选自以下分子式(I)或(II)或其生物学上可接受的盐或溶剂化物：其中：化学式(I)或(II)各自可以是α或β异头物或对应的醛糖形式；R1至R4各自独立地选自以下基团：-OH、-OC(O)H、-OC(O)C1-C10烷基、-OC(O)C2-C10烯基、-OC(O)C2-C10炔基、-OC(O)芳基，-OC(O)杂环、-OC(O)C1-C10亚烷基(芳基)、-OC(O)C2-C10亚烯基(芳基)、-OC(O)C2-C10亚炔基(芳基)、-OC(O)C1-C10亚烷基(杂环)、-OC(O)C2-C10亚烯基(杂环)、-OC(O)C2-C10亚炔基(杂环)、-OCH2OC(O)烷基、-OCH2OC(O)O烷基、-OCH2OC(O)芳基、-OCH2OC(O)O芳基、-OC(O)CH2O(CH2CH2O)nCH3、-OC(O)CH2CH2O(CH2CH2O)nCH3、-O-三-C1-C3烷基甲硅烷基、-OC1-C10烷基，其中各n是独立选自于0-5的整数；并且R5选自下组：-C≡CH、-C≡CCH3、-CH2C≡CH、-C(O)OCH3、-CH(OAc)CH3、-CN、-CH2CN、-CHX2(其中各X是F、Br或Cl)，-CH2X(其中X是F、Br、Cl或I)和甲基环氧乙烷。3.如权利要求1或2所述的用途，其特征在于，所述药物用于治疗或预防癌症。4.如权利要求1或2所述的用途，其特征在于，所述药物用于治疗自体免疫疾病。5.如权利要求1或2所述的用途，其特征在于，所述药物与治疗或预防癌症的化疗剂联用。6.如权利要求1或2所述的用途，其特征在于，R1至R4各自独立地选自下组：-OH、-OC(O)H、-OC(O)C1-C10烷基、-OC(O)C2-C10烯基、-OC(O)C2-C10炔基、-OC(O)芳基、-OC(O)杂环、-OC(O)C1-C10亚烷基(芳基)、-OC(O)C2-C10亚烯基(芳基)、-OC(O)C2-C10亚炔基(芳基)、-OC(O)C1-C10亚烷基(杂环)、-OC(O)C2-C10亚烯基(杂环)、-OC(O)C2-C10亚炔基(杂环)、-OC(O)CH2O(CH2CH2O)nCH3和-OC(O)CH2CH2O(CH2CH2O)nCH3；并且R5选自下组：-C≡CH、-C≡CCH3、-CH2C≡CH、-C(O)OCH3、-CH(OAc)CH3、-CN、-CH2CN、-CH2X(其中X是F、Br、Cl或I)和甲基环氧乙烷。7.如权利要求1或2所述的用途，其特征在于，R1至R4各自独立地选自下组：-OH-OC(O)H和-OC(O)C1-C10烷基。8.如权利要求7所述的用途，其特征在于，R1至R4各自独立地选自-OH和–OAc。9.如权利要求1或2所述的用途，其特征在于，R5选自-C≡CH和-C≡CCH3。10.如权利要求9所述的用途，其特征在于，R5为-C≡CH。11.如权利要求1或2所述的用途，其特征在于，R5为-CH2X，其中X是F、Br、Cl或I。12.如权利要求11所述的用途，其特征在于，R5为-CH2X，其中X是F。13.如权利要求11所述的用途，其特征在于，R5为-CH2X，其中X是Br。14.如权利要求1或2所述的用途，其特征在于，R5为-CHX2，其中X是F。15.如权利要求1或2所述的用途，其特征在于，R5为-CHX2，其中X是F。16.如权利要求1或2所述的用途，其特征在于，R5为-CHF2并且R1至R4为OAc。17.如权利要求1或2所述的用途，其特征在于，R5为–CH2Br并且R1-R4为-OAc。18.如权利要求1或2所述的用途，其特征在于，R5为-C≡CH并且R1-R4为-OAc。19.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述岩藻糖类似物选自分子式(III)或(IV)其中之一或其生物学上可接受的盐或溶剂化物：其中化学式(III)或(IV)各自可以是α或β异头物或对应的醛糖形式；R1至R4各自独立地选自：氟、氯、OH、-OC(O)H、-OC(O)C1-C10烷基、-OC(O)C2-C10烯基、-OC(O)C2-C10炔基、-OC(O)芳基、-OC(O)杂环、-OC(O)C1-C10亚烷基(芳基)、-OC(O)C2-C10亚烯基(芳基)、-OC(O)C2-C10亚炔基(芳基)、-OC(O)C1-C10亚烷基(杂环)、-OC(O)C2-C10亚烯基(杂环)、-OC(O)C2-C10亚炔基(杂环)、-OCH2OC(O)烷基、-OCH2OC(O)O烷基、-OCH2OC(O)芳基、-OCH2OC(O)O芳基、-OC(O)CH2O(CH2CH2O)nCH3、-OC(O)CH2CH2O(CH2CH2O)nCH3、-O-三-C1-C3烷基甲硅烷基与-OC1-C10烷基、其中各n独立选自0-5的整数；并且R2a至R3a各自独立地选自H、F与Cl；R5选自下组：-CH3，-CHF2，-CH＝C＝CH2，-C≡CH，-C≡CCH3，-CH2C≡CH，-C(O)OCH3，-CH(OAc)CH3，-CN，-CH2CN，-CH2X(其中X是F、Br、Cl或I)和甲基环氧乙烷。20.如权利要求19所述的用途，其特征在于，R1为F。21.如权利要求19所述的用途，其特征在于，R2为F。22.如权利要求19所述的用途，其特征在于，R3为F。23.如权利要求19所述的用途，其特征在于，R2与R2a分别为F。24.如权利要求19所述的用途，其特征在于，R1与R2分别为F。25.如权利要求19所述的用途，其特征在于，R2a与R3a分别为氢。26.如权利要求1所述的用途，其特征在于，R5选自下组：-CH3、-C...

【专利技术属性】
技术研发人员：P·森特，S·阿利，D·本杰明，
申请(专利权)人：西雅图基因公司，
类型：发明
国别省市：美国;US