基于ARMS‑PCR法检测BMP3和NDRG4基因甲基化的荧光PCR方法、试剂盒及体系技术

本发明专利技术公开了一种基于ARMS‑PCR法检测BMP3和NDRG4基因甲基化的荧光PCR方法、试剂盒及体系。方法包括：(a)对含有BMP3和NDRG4基因的DNA材料中的CpG位点进行转换处理，使得未甲基化的CpG位点转换为UpG；(b)以转换处理后的DNA材料作为模板进行荧光PCR反应，荧光PCR体系中包括：用于检测BMP3基因甲基化的特异性引物及其探针序列，用于检测NDRG4基因甲基化的特异性引物及其探针序列，Taq酶、UNG酶、dNTPs、dUTP、Mg

PCR method, fluorescence detection of BMP3 and methylation of NDRG4 gene ARMS PCR kit and system based on

The invention discloses a fluorescent PCR detection method, BMP3 and methylation of NDRG4 gene ARMS kit based on PCR method and system. The method includes: (a) for conversion of the CpG site containing BMP3 and NDRG4 genes in DNA material, the CpG methylation sites were not converted to UpG; (b) to convert the treated DNA material is used as the template for fluorescent PCR reaction, including fluorescence in PCR system: for the detection of BMP3 gene methylation specific primers and probe sequences for the detection of NDRG4 gene methylation specific primer and probe sequence, Taq enzyme and UNG enzyme, dNTPs, dUTP, Mg

【技术实现步骤摘要】
基于ARMS-PCR法检测BMP3和NDRG4基因甲基化的荧光PCR方法、试剂盒及体系
本专利技术涉及基因甲基化水平检测
，尤其涉及一种基于ARMS-PCR法检测BMP3和NDRG4基因甲基化的荧光PCR方法、试剂盒及体系。
技术介绍
粪便既含有脱落的正常结直肠上皮细胞和游离的DNA，也含有大量从结直肠癌上脱落的癌细胞和游离的癌DNA；又由于肠道是碱性环境，有利于DNA的保存，使从粪便中提取的DNA质量较好。因此粪便基因甲基化作为一种新的、敏感度高、特异性中等的无创性结直肠肿瘤标志物，能根据其阳性结果对疑似病例进行进一步检测，作为相关肿瘤的早期筛查手段具有很重要的临床价值。石蜡组织切片不仅用于观察正常细胞组织的形态结构，还用于研究、观察及判断细胞组织的形态变化的主要手段，由于生物组织经过固定、石蜡包埋后能够完好的保存其形态结构，大量的细胞内DNA遗传物质得以完好保存在石蜡组织当中，经过脱蜡、细胞消化、DNA提取等步骤能够将这些保存下来的DNA遗传物质释放出来。同时，石蜡组织切片也是一种短期内获取大量人体新鲜组织标本的有效方式，且部分研究涉及回顾性分析，也需要借助于病理科等长期保存的福尔马林固定石蜡包埋组织。因此，无论是作为相关肿瘤的早期筛查手段，还是从基因水平阐明肿瘤发病机制，石蜡切片组织都具有很重要的早期检测、研究用临床价值。骨形态发生蛋白基因(BMP3)属于转化生长因子-β(TGF-β)超家族成员，最初由于具有诱导异位骨和软骨形成的能力而被命名。近年研究表明，BMP3基因与某些肿瘤发生、发展及转移密切相关，在结直肠癌(CRC)以及肺癌中BMP3基因的表达水平都被抑制，预示着BMP3基因甲基化水平可作为结直肠癌(CRC)以及肺癌早起发生的重要生物学特征。NDRG4基因全长32kb，由17个外显子及l6个内含子组成，属于抑癌基因NDRG基因家族成员，该基因家族在人体多种正常组织中高表达，在某些肿瘤组织中不表达或低表达，低表达可能与启动子高甲基化相关，其基因5＇端调控区域含有CpG岛，在结直肠癌发生发展过程中常常被甲基化。因此，NDRG4基因甲基化亦被认为是结直肠癌的重要生物学特征。目前临床检测DNA中基因甲基化的方法主要有3种：1)直接测序法，是目前应用最多的一种检测方法，主要是Sanger测序，当组织样本DNA经过甲基化转换试剂盒处理后，经过有效富集才能被测序，优点是结果准确可靠，能读取到被检测序列信息，但其有效富集甲基化基因区域，在转换试剂盒转换效率不高、甲基化基因含量低的情况下面临极大的挑战，一般用来确认其他检测阳性结果。2)荧光定量PCR法，在荧光定量PCR平台上，利用特异的引物对DNA甲基化区域进行PCR扩增，利用荧光标记探针对扩增产物进行突变检测，这样检测方法特异性强、灵敏度高，可检测到DNA含量低至1％的突变，但目前用于基因甲基化检测通常为单一CpG位点，即通过MGB探针区分单一CpG位点，甲基化信息不全面易造成假阳性结果，同时q-PCR平台单一检测通量不高，探针成本昂贵，很难适应临床大通量样本的风险预测。3)高通量测序技术法，一般利用PCR技术对甲基化目标区域进行富集，然后构建适合于NGS上机测序的文库，最后上机测序，信息分析获得感兴趣甲基化目标区域序列信息。但是在目前对甲基化目标区域富集过程中，富集的特异性和有效性在不同的实验平台差距大，而且普通的建库流程繁杂、周期长、成本高，这些因素都造成甲基化基因高通量测序的限制因素。因此，目前急需一种能够检测样品DNA中基因0.1～1％低频甲基化水平，检测结果可快速、直观、方便进行判别，成本较低的基因甲基化检测方法和试剂盒。
技术实现思路
本专利技术提供一种基于ARMS-PCR法检测BMP3和NDRG4基因甲基化的荧光PCR方法、试剂盒及体系，只有在5～15个连续CpG位点甲基化时才检出荧光PCR信号，避免1个CpG位点甲基化代表整个基因甲基化水平的假阳性现象；甲基化水平检测限低至0.1～1％，灵敏度高。根据本专利技术的第一方面，本专利技术提供一种基于ARMS-PCR法检测BMP3和NDRG4基因甲基化的荧光PCR方法，包括：(a)对含有上述BMP3和NDRG4基因的DNA材料中的CpG位点进行转换处理，使得未甲基化的CpG位点转换为UpG；(b)在荧光PCR体系中，以上述转换处理后的DNA材料作为模板进行荧光PCR反应，其中上述荧光PCR体系中包括：(b1)用于检测BMP3基因甲基化的特异性引物及其探针序列：上游引物序列为：GAGTTTAAGTTTCGGTTTCdITC(SEQIDNO：1)，荧光探针序列为：GCAAAAAACCGACGACGAAA(SEQIDNO：2)，下游引物序列为：GTCGCTACGCAACACTdICG(SEQIDNO：3)；(b2)用于检测NDRG4基因甲基化的特异性引物及其探针序列：上游引物序列为：TTTCGCGTCGCGGTTGTCGdITC(SEQIDNO：4)，荧光探针序列为：TTTTTCGTTCGTTTATCGGGTATTTTAGT(SEQIDNO：5)，下游引物序列为：GTCGCTACGACACACTdICG(SEQIDNO：6)；其中，上述引物序列中的dI表示脱氧次黄嘌呤核苷酸；上述荧光探针序列的5’端具有荧光基团，3’端具有淬灭基团和小沟结合分子(MinorGrooveBinder，MGB)；(b3)Taq酶、UNG酶(Uracil-N-glycosylase，尿嘧啶-N-糖基化酶)、dNTPs(包括dATP、dCTP、dGTP、dTTP)、dUTP、Mg2+和PCR缓冲液；(b4)第一添加剂和第二添加剂，上述第一添加剂包括牛血清白蛋白，上述第二添加剂包括二甲基亚砜、NH4Cl和山梨糖醇水溶液。进一步地，上述荧光基团是FAM，上述淬灭基团是BHQ1。当然，荧光基团也可以是HEX、TET等其他荧光基团，淬灭基团也可以是TAMRA等其他淬灭基团。进一步地，上述荧光PCR体系中还包括：用于检测作为内标的ACTB基因甲基化的特异性引物及其探针序列：上游引物序列为：AAAGGGTGTAGTGTTGGGAGGTTA(SEQIDNO：7)，荧光探针序列为：TCTTCTAATAACCACCTCCCTCCTT(SEQIDNO：8)，下游引物序列为：AAAACCAACCACAAAACAA(SEQIDNO：9)；其中，上述荧光探针序列的5’端具有荧光基团VIC，3’端具有淬灭基团BHQ1。进一步地，每50μL上述荧光PCR体系中含有：Taq酶、UNG酶2个单位；10mM的dNTPs(包括dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2.5mM)和2.5mM的dUTP0.4μL；50mM的Mg2+1.5μL；10×PCR缓冲液5μL；10μM的引物序列各自1μL，10μM的探针序列各自1.5μL；作为模板的转换处理后的DNA材料20～40ng；10mg/mL牛血清白蛋白2μL，二甲基亚砜、250mMNH4Cl和60％山梨糖醇水溶液1.25μL，以及余量的水。进一步地，上述每50μL上述荧光PCR体系中还含有：10μM的上述内标的引物序列各自1μL，以及10μM的上述内标的探针序列0.5μL；上述内标的引物序列和探针序列包括：用于检本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于ARMS‑PCR法检测BMP3和NDRG4基因甲基化的荧光PCR方法，其特征在于，包括：(a)对含有所述BMP3和NDRG4基因的DNA材料中的CpG位点进行转换处理，使得未甲基化的CpG位点转换为UpG；(b)在荧光PCR体系中，以所述转换处理后的DNA材料作为模板进行荧光PCR反应，其中所述荧光PCR体系中包括：(b1)用于检测BMP3基因甲基化的特异性引物及其探针序列：上游引物序列为：GAGTTTAAGTTTCGGTTTCdITC(SEQ ID NO：1)，荧光探针序列为：GCAAAAAACCGACGACGAAA(SEQ ID NO：2)，下游引物序列为：GTCGCTACGCAACACTdICG(SEQ ID NO：3)；(b2)用于检测NDRG4基因甲基化的特异性引物及其探针序列：上游引物序列为：TTTCGCGTCGCGGTTGTCGdITC(SEQ ID NO：4)，荧光探针序列为：TTTTTCGTTCGTTTATCGGGTATTTTAGT(SEQ ID NO：5)，下游引物序列为：GTCGCTACGACACACTdICG(SEQ ID NO：6)；其中，所述引物序列中的dI表示脱氧次黄嘌呤核苷酸；所述荧光探针序列的5’端具有荧光基团，3’端具有淬灭基团和小沟结合分子；(b3)Taq酶、UNG酶、dNTPs、dUTP、Mg...

【技术特征摘要】
1.一种基于ARMS-PCR法检测BMP3和NDRG4基因甲基化的荧光PCR方法，其特征在于，包括：(a)对含有所述BMP3和NDRG4基因的DNA材料中的CpG位点进行转换处理，使得未甲基化的CpG位点转换为UpG；(b)在荧光PCR体系中，以所述转换处理后的DNA材料作为模板进行荧光PCR反应，其中所述荧光PCR体系中包括：(b1)用于检测BMP3基因甲基化的特异性引物及其探针序列：上游引物序列为：GAGTTTAAGTTTCGGTTTCdITC(SEQIDNO：1)，荧光探针序列为：GCAAAAAACCGACGACGAAA(SEQIDNO：2)，下游引物序列为：GTCGCTACGCAACACTdICG(SEQIDNO：3)；(b2)用于检测NDRG4基因甲基化的特异性引物及其探针序列：上游引物序列为：TTTCGCGTCGCGGTTGTCGdITC(SEQIDNO：4)，荧光探针序列为：TTTTTCGTTCGTTTATCGGGTATTTTAGT(SEQIDNO：5)，下游引物序列为：GTCGCTACGACACACTdICG(SEQIDNO：6)；其中，所述引物序列中的dI表示脱氧次黄嘌呤核苷酸；所述荧光探针序列的5’端具有荧光基团，3’端具有淬灭基团和小沟结合分子；(b3)Taq酶、UNG酶、dNTPs、dUTP、Mg2+和PCR缓冲液；(b4)第一添加剂和第二添加剂，所述第一添加剂包括牛血清白蛋白，所述第二添加剂包括二甲基亚砜、NH4Cl和山梨糖醇水溶液。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述荧光基团是FAM，所述淬灭基团是BHQ1。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述荧光PCR体系中还包括：用于检测作为内标的ACTB基因甲基化的特异性引物及其探针序列：上游引物序列为：AAAGGGTGTAGTGTTGGGAGGTTA(SEQIDNO：7)，荧光探针序列为：TCTTCTAATAACCACCTCCCTCCTT(SEQIDNO：8)，下游引物序列为：AAAACCAACCACAAAACAA(SEQIDNO：9)；其中，所述荧光探针序列的5’端具有荧光基团VIC，3’端具有淬灭基团BHQ1。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，每50μL所述荧光PCR体系中含有：Taq酶、UNG酶2个单位；10mM的dNTPs和2.5mM的dUTP0.4μL；50mM的Mg2+1.5μL；10×PCR缓冲液5μL；10μM的引物序列各自1μL，10μM的探针序列各自1.5μL；作为模板的转换处理后的DNA材料20～40ng；10mg/mL牛血清白蛋白2μL，二甲基亚砜、250mMNH4Cl和60％山梨糖醇水溶液1.25μL，以及余量的水。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述每50μL所述荧光PCR体系中还含有：10μM的所述内标的引物序列各自1μL，以及10μM的所述内标的探针序列0.5μL；所述内标的引物序列和探针序列包括：用于检测作为内标的ACTB基因甲基化的特异性引物及其探针序列：上游引物序列为：AAAGGGTGTAGTGTTGGGAGGTTA(SEQIDNO：7)，荧光探针序列为：TCTTCTAATAACCACCTCCCTCCTT(SEQIDNO：8)，下游引物序列为：AAAACCAACCACAAAACAA(SEQIDNO：9)；其中，所述荧光探针序列的5’端具有荧光基团VIC，3’端具有淬灭基团BHQ1。6.根据权利要求1至5任一项所述的方法，其特征在于，所述荧光PCR反应的程序为：50℃反应2min；95℃反应5min；95℃反应15s然后60℃反应30s进行15个循环；95℃反应15s然后60℃反应30s进行30个循环并收集荧光信号；20℃反应2min。7.一种基于ARMS-PCR法检测BMP3和NDRG4基因甲基化的荧光PCR试剂盒，其特征在于，包括：(1)用于检测BMP3基因甲基化的特异性引物及其探针序列：上游引物序列为：GAGTTTAAGTTTCGGTTTCdITC(SEQIDNO：1)，荧光探针序列为：GCAAAAAACCGA...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄临迷，宋卓，袁梦兮，
申请(专利权)人：人和未来生物科技长沙有限公司，
类型：发明
国别省市：湖南,43