一种庆大霉素C1a的检测方法技术

本发明专利技术公开了一种庆大霉素C1a的检测方法，其包括如下步骤：将含有庆大霉素C1a的待测样品和衍生化试剂混合均匀并进行衍生化反应，然后进行液相色谱或液相色谱-质谱联用方法检测，即可；其中，所述衍生化试剂包含溶剂、邻苯二甲醛、巯基乙酸及缓冲溶液这几种组分；所述衍生化试剂中邻苯二甲醛与巯基乙酸的摩尔比为1:3.8～1:0.5；所述衍生化试剂的pH＝10～11；单次检测结果中所用衍生化试剂中邻苯二甲醛的摩尔量与所述待测样品中所测得的庆大霉素C1a的摩尔量的比值需大于等于3.59。本发明专利技术的庆大霉素C1a的检测方法操作简单，在检测生产样品中庆大霉素C1a浓度时准确性较高、线性范围广。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种庆大霉素C1a的检测方法。
技术介绍
现有庆大霉素C1a的HPLC柱前衍生化检测方法，一般为美国药典USP35-nf30版中对庆大霉素硫酸盐的检测方法。例如，准确量取10mL样品到容量瓶中，加入5mL异丙醇和4mLOPA衍生化试剂混匀，再用异丙醇定容至25mL，充分混匀后密闭，60℃水浴15min后置于冰水中终止反应，12000rmp离心5分钟后即可进行HPLC检测。其中，所使用的OPA衍生化试剂配方：邻苯二甲醛1g(0.0074mol)，溶于5ml甲醇中，加入巯基乙酸2ml(0.0288mol)，最后加0.4mol/L硼酸(45％氢氧化钠调pH值10.4)95ml混匀，再用45％氢氧化钠调pH10.4，放冰箱避光保存。这一方法在工业生产中适用范围有限，线性范围窄，导致庆大霉素C1a浓度的检测结果准确性非常差。而实际生产过程中，浓度较高且纯度较低的庆大霉素C1a样品是人们经常要检测的对象，因此，发展一种准确性较高、线性范围广的庆大霉素C1a样品的衍生化试剂，是本领域亟待解决的问题。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是为了克服现有技术中庆大霉素C1a在检测浓度时，线性范围窄、适用范围有限等缺陷，而提供了一种庆大霉素C1a的检测方法。本专利技术的庆大霉素C1a的检测方法操作简单，在检测生产样品中庆大霉素C1a浓度时准确性较高、线性范围广。本专利技术提供了一种庆大霉素C1a的检测方法，其包括如下步骤：将含有庆大霉素C1a的待测样品和衍生化试剂混合均匀并进行衍生化反应，然后进行液相色谱或液相色谱-质谱联用方法检测，即可；其中，所述衍生化试剂包含溶剂、邻苯二甲醛、巯基乙酸及缓冲溶液这几种组分；所述衍生化试剂中邻苯二甲醛与巯基乙酸的摩尔比为1:3.8～1:0.5；所述衍生化试剂的pH＝10～11；如果单次检测结果中所用衍生化试剂中邻苯二甲醛的摩尔量与所述待测样品中所测得的庆大霉素C1a的摩尔量的比值大于等于3.59，即为检测结果；如果单次检测结果中所用衍生化试剂中邻苯二甲醛的摩尔量与所述待测样品中所测得的庆大霉素C1a的摩尔量的比值小于3.59时，需提高单次检测中所述邻苯二甲醛与所述待测样品中庆大霉素C1a的实际摩尔比，进行重新检测，直至单次检测结果中“所用衍生化试剂中邻苯二甲醛的摩尔量与所述待测样品中所测得的庆大霉素C1a的摩尔量的比值”大于等于3.59为止；所述含有庆大霉素C1a的待测样品为发酵产物中含有庆大霉素C1a的发酵液经过纯化预处理后所形成的待测样品。较佳地，所述衍生化试剂中邻苯二甲醛与巯基乙酸的摩尔比为1：3.24～1:0.5，更佳地为1:1.2～1:0.8。所述提高单次检测中所述邻苯二甲醛与所述待测样品中庆大霉素C1a的实际摩尔比的方法，较佳地为，在所述衍生化试剂各组分浓度、所述待测样品各组分浓度均不变的条件下提高检测体系中所述衍生化试剂与所述待测样品的质量比；或者为，在所述衍生化试剂与所述待测样品的质量比不变的条件下，对所述待测样品进行稀释和/或对所述衍生化试剂进行浓缩。所述含有庆大霉素C1a的发酵液可为本领域各种常规代谢庆大霉素C1a的微生物培养发酵所得。较佳地，所述代谢庆大霉素C1a的微生物为绛红小单孢菌(Micromonmsporapurpurea)。所述的绛红小单孢菌较佳地购自中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)保藏的菌株编号为CICC11015的绛红小单孢菌。上述绛红小单孢菌均可在上述保藏中心购买得到。较佳地，所述发酵液为放罐发酵液。较佳地，所述纯化预处理为：将所述发酵液进行酸化处理使庆大霉素C1a释放出来，并固液分离后，滤液即为所述含有庆大霉素C1a的待测样品。较佳地，所述纯化预处理还可包括如下步骤：在所述固液分离后，将所述滤液用阳离子交换树脂进行吸附，然后用碱水洗脱，洗脱液即为所述含有庆大霉素C1a的待测样品。较佳地，所述阳离子交换树脂为HZ-732阳离子交换树脂。较佳地，所述酸化处理为将所述发酵液用硫酸水溶液调pH至1.5～2.5(更佳地为1.5～2.0)。较佳地，所述酸化处理的过程还进行静置。较佳地，所述静置的时间为1～4小时。较佳地，所述硫酸水溶液中硫酸浓度为4～18M，例如9M。较佳地，所述固液分离为采用过板框进行固液分离或离心分离。较佳地，所述碱水为1mol/L～5mol/LNaOH水溶液。较佳地，所述酸水为0.2mol/L～2mol/L硫酸水溶液。较佳地，所述衍生化试剂是其各组分均匀混合后所形成的溶液。较佳地，所述衍生化试剂中邻苯二甲醛与所述衍生化试剂的质量体积比为0.01g/mL～0.08g/mL；更佳地为0.012g/mL～0.04g/mL。所述溶剂可为本领域各种常规溶剂，较佳地为醇类溶剂、酯类溶剂和醚类溶剂中的一种或多种。较佳地，所述醇类溶剂为甲醇、乙醇和丙醇中的一种或多种。所述溶剂的用量可为本领域常规用量，较佳地，所述溶剂与所述邻苯二甲醛的体积质量比为1mL/g～10mL/g；更佳地为1.25mL/g～5mL/g。所述缓冲溶液可为本领域各种常规缓冲溶液，较佳地为硼酸水溶液、硼砂水溶液和磷酸盐水溶液中的一种或多种。较佳地，所述硼酸水溶液中硼酸的摩尔浓度为0.2mol/L～0.5mol/L；更佳地为0.4mol/L～0.45mol/L。较佳地，所述硼酸水溶液的pH为10～11；更佳地为10.4～11.0。较佳地，所述硼酸水溶液的pH是通过质量分数为40％～50％(更佳地为45％)或饱和的氢氧化钠的水溶液和/或质量分数为40％～50％或饱和的氢氧化钾(更佳地为45％)的水溶液进行调节。较佳地，所述衍生化试剂的pH是通过质量分数为40％～50％(更佳地为45％)或饱和的氢氧化钠的水溶液和/或质量分数为40％～50％或饱和的氢氧化钾(更佳地为45％)的水溶液进行调节。所述缓冲溶液的用量可为本领域各种常规用量，较佳地，所述溶剂与所述缓冲溶液的体积比为1:12～1:20；更佳地为1:19～1:13。较佳地，所述衍生化反应在进行前，还将反应体系与异丙醇混合均匀。较佳地，所述异丙醇与所述反应体系的体积比为1：1～1：2。较佳地，所述衍生化反应是在密闭条件下进行。较佳地，所述衍生化反应的温度为40～60℃；更佳地为60～65℃。较佳地，所述衍生化反应的时间为10～20min；更佳地为15～17min。较佳地，所述衍生化反应在结束后，还包括后处理的操作。较佳地，所述后处理的操作为：采用将反应体系置于-10～0℃来终止反应，离心取上清液。较佳地，所述离心的转速为12000rmp～14000rmp。较佳地，所述离心的时间为5～10min。较佳地，所述液相色谱或液相色谱-质谱联用方法检测中，所用色谱柱为C18色谱柱。所述C18色谱柱较佳地为纳微(Nano-Micro)公司的型号为Unisil5-120C18的C18色谱柱。较佳地，所述C18色谱柱的填料粒径为5μm。较佳地，所述C18色谱柱的长度为250mm。较佳地，所述C18色谱柱的直径为4.6mm。较佳地，所述液相色谱或液相色谱-质谱联用方法检测中，所用流动相为体积比为4:1:15的庚烷磺酸钠水溶液、冰醋酸和甲醇的混合液；所述庚烷磺酸钠水溶液中庚烷磺酸钠的质量浓度为5g本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种庆大霉素C1a的检测方法，其特征在于，其包括如下步骤：将含有庆大霉素C1a的待测样品和衍生化试剂混合均匀并进行衍生化反应，然后进行液相色谱或液相色谱‑质谱联用方法检测，即可；其中，所述衍生化试剂包含溶剂、邻苯二甲醛、巯基乙酸及缓冲溶液这几种组分；所述衍生化试剂中邻苯二甲醛与巯基乙酸的摩尔比为1:3.8～1:0.5；所述衍生化试剂的pH＝10～11；如果单次检测结果中所用衍生化试剂中邻苯二甲醛的摩尔量与所述待测样品中所测得的庆大霉素C1a的摩尔量的比值大于等于3.59，即为检测结果；如果单次检测结果中所用衍生化试剂中邻苯二甲醛的摩尔量与所述待测样品中所测得的庆大霉素C1a的摩尔量的比值小于3.59时，需提高单次检测中所述邻苯二甲醛与所述待测样品中庆大霉素C1a的实际摩尔比，进行重新检测，直至单次检测结果中“所用衍生化试剂中邻苯二甲醛的摩尔量与所述待测样品中所测得的庆大霉素C1a的摩尔量的比值”大于等于3.59为止；所述含有庆大霉素C1a的待测样品为发酵产物中含有庆大霉素C1a的发酵液经过纯化预处理后所形成的待测样品。

【技术特征摘要】
1.一种庆大霉素C1a的检测方法，其特征在于，其包括如下步骤：将含有庆大霉素C1a的待测样品和衍生化试剂混合均匀并进行衍生化反应，然后进行液相色谱或液相色谱-质谱联用方法检测，即可；其中，所述衍生化试剂包含溶剂、邻苯二甲醛、巯基乙酸及缓冲溶液这几种组分；所述衍生化试剂中邻苯二甲醛与巯基乙酸的摩尔比为1:3.8～1:0.5；所述衍生化试剂的pH＝10～11；如果单次检测结果中所用衍生化试剂中邻苯二甲醛的摩尔量与所述待测样品中所测得的庆大霉素C1a的摩尔量的比值大于等于3.59，即为检测结果；如果单次检测结果中所用衍生化试剂中邻苯二甲醛的摩尔量与所述待测样品中所测得的庆大霉素C1a的摩尔量的比值小于3.59时，需提高单次检测中所述邻苯二甲醛与所述待测样品中庆大霉素C1a的实际摩尔比，进行重新检测，直至单次检测结果中“所用衍生化试剂中邻苯二甲醛的摩尔量与所述待测样品中所测得的庆大霉素C1a的摩尔量的比值”大于等于3.59为止；所述含有庆大霉素C1a的待测样品为发酵产物中含有庆大霉素C1a的发酵液经过纯化预处理后所形成的待测样品。2.如权利要求1所述的庆大霉素C1a的检测方法，其特征在于：所述衍生化试剂中邻苯二甲醛与巯基乙酸的摩尔比为1：3.24～1:0.5。3.如权利要求1所述的庆大霉素C1a的检测方法，其特征在于：所述衍生化试剂中邻苯二甲醛与巯基乙酸的摩尔比为1:1.2～1:0.8。4.如权利要求1～3中任一项所述的庆大霉素C1a的检测方法，其特征在于：所述提高单次检测中所述邻苯二甲醛与所述待测样品中庆大霉素C1a的实际摩尔比的方法为，在所述衍生化试剂各组分浓度、所述待测样品各组分浓度均不变的条件下提高检测体系中所述衍生化试剂与所述待测样品的质量比；或者为，在所述衍生化试剂与所述待测样品的质量比不变的条件下，对所述待测样品进行稀释和/或对所述衍生化试剂进行浓缩；和/或，所述含有庆大霉素C1a的发酵液为代谢庆大霉素C1a的微生物
\t培养发酵所得；所述代谢庆大霉素C1a的微生物为绛红小单孢菌；和/或，所述发酵液为放罐发酵液；和/或，所述纯化预处理为：将所述发酵液进行酸化处理使庆大霉素C1a释放出来，并固液分离后，滤液即为所述含有庆大霉素C1a的待测样品。5.如权利要求4所述的庆大霉素C1a的检测方法，其特征在于：所述酸化处理为将所述发酵液用硫酸水溶液调pH至1.5～2.5；和/或，所述酸化处理的过程还进行静置；和/或，所述固液分离为采用过板框进行固液分离或离心分离；和/或，所述纯化预处理还包括如下步骤：在所述固液分离后，将所述滤液用阳离子交换树脂进行吸附，然后用碱水洗脱，洗脱液即为所述含有庆大霉素C1a的待测样品。6.如权利要求5所述的庆大霉素C1a的检测方法，其特征在于：所述静置的时间为1～4小时；和/或，所述硫酸水溶液中硫酸浓度为4～1...

【专利技术属性】
技术研发人员：李继安，林惠敏，陈齐，丁碧粉，张韬，李亚军，张羡媛，刘一阳，张骏梁，张建斌，
申请(专利权)人：上海医药工业研究院，中国医药工业研究总院，
类型：发明
国别省市：上海;31