DNA检测法制造技术

本发明专利技术介绍了一种ＤＮＡ检测法，它包括对与靶ＤＮＡ或ＲＮＡ杂交的ＤＮＡ探针或ＲＮＡ探针的末端进行化学修饰的第一方法，用核酸外切酶消化未修饰的ＤＮＡ探针或ＲＮＡ探针的第二方法以及检测第一方法中被化学修饰的ＤＮＡ或ＲＮＡ探针的第三方法。按照本发明专利技术，只有处于杂交中的ＤＮＡ探针才能以高灵敏度进行检测。（*该技术在2013年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种检测DNA和RNA的方法。作为检测DNA的方法，PCR(聚合酶链反应)和DNA探针法被广泛使用。前一方法包括通过重复的DNA链聚合酶反应产生目的DNA特定区的大量拷贝，其优点是可以检测微量的DNA(即使起始DNA是一个拷贝，该方法也可应用)。DNA探针法因其步骤简单而具有很广的应用性，但是，为了进一步与非放射性同位素法一起应用，其检测灵敏性有待改进，DNA探针法分为两种方法，一种方法包括将目的DNA进行凝胶电泳并将分离图谱固定在滤纸上，以便通过放射自显影或利用化学发光检测DNA(即Southern印迹法)，另一种方法包括未经分离步骤将DNA固定在滤纸上进行检测(点印迹法)。另一种方法包括将DNA探针与目的DNA在溶液中杂交，然后用荧光等检测DNA。在溶液中进行的该方法很容易实现自动化，因此很有前景。该方法的一个例子是一种利用可与目的DNA杂交的荧光基团标记的探针A和用磁性珠固定的探针B的方法。尽管一般来说探针A和B彼此不反应，但当存在目的DNA时它们则能相互反应(三明治法)。因此，通过测定与探针B反应的探针A，就可定量测定目的DNA。还有另外一种方法，它包括将两种类型的荧光基团与下面设计的DNA探针结合;当探针处于DNA本身次级构型中的游离状态时，两类荧光基团可被置于彼此靠近的位置，而当DNA探针处于杂交状态时两类荧光基团可彼此公开。当两类荧光基团处于彼此靠近的状态时，激发能量的迁移通过两类荧光基团的反应而发生，而当两类荧光基团分开放量时不发生此种迁移。因此，可通过利用发射光谱随状态的不同而发生的变化来分析杂交探针。PCR尽管是一种有效方法，但是该方法的缺点在于对于每一样品DNA，需要两个DNA探针来作为互补伸长的引物，因此需要花费大量劳力来分析各种样品。或者，对于包括检测DNA探针的方法，其灵敏性不能令人满意;或者是该方法不能提供详细信息;或者是用于测定不同的多个DNA区的样品不能被同时检测。本专利技术的目的在于提供一种通过使用DNA探针检测的简单方式以高灵敏性检测位于多个区域中的DNA的方法。为了达到上述目的，本专利技术的检测方法包括三个方法，第一方法包括将DNA探针杂化在目的DNA上，并通过酶促反应对杂交DNA探针的末端进行不可逆修饰，例如，可通过将被DNA聚合酶进行过化学修饰的核苷酸(不再具有延长互补链的能力)插入末端，或者是通过用连接酶将具有无活性末端基团的低聚物与DNA探针连接来完成这种修饰。第二方法是切断或除去非反应DNA探针的方法。在该方法中，切断反应是为了切掉未反应的DNA，但该反应并不发生在第一方法中产生的化学修饰过的DNA探针上。例如，在第一方法中，化学修饰的二脱氧核苷酸被加至具有荧光基团标记的5′末端的DNA探针的3′端以封阻3′-末端，然后，用核酸外切酶消化具有未修饰3′末端的DNA探针。第三方法包括利用磁性珠或可与DNA探针结合的类似物从DNA探针或反应底物的消化产物中分离化学修饰的DNA探针，并通过电泳分离和检测化学修饰的DNA探针。在利用DNA探针检测靶DNA时，区分“杂交在靶DNA上的DNA探针”与“未杂交的DNA探针”非常重要。按照本专利技术的方法，杂交DNA探针通过酶促反应进行了末端修饰，然后通过酶促末端消化将具有修饰末端的DNA探针消化成片段。接着，利用长度或DNA杂交能力的不同分离和除去片段，并检测靶DNA。因此，通过这一方法可达到高灵敏检测，同时本底信号被较少抑制。具体地说，在DNA探针处于与靶DNA杂交状态时，通过酶促反应将检测标记如荧光基团引入DNA探针，就可以高灵敏性地检测出靶DNA。这里，术语“化学修饰”指“将官能基结合至DNA末端或将带有官能基的核苷酸连接至末端，从而抑制作为对低聚核苷酸进行末端消化的酶的核酸外切酶的活性。”杂交在目的DNA上的DNA探针的长度应为6-mers或更多。如果低于6-mers，杂交可能很不利地基本不发生。由于DNA探针是通过化学合成制备的，从实际角度考虑，为了防止这一制备过程所需时间过长，DNA探针的长度应为40-mers或更低。但是，该长度可能为或可能不为40-mers或更多。寡核苷酸被用作这类，DNA探针。磁性珠的例子有由静磁细菌制备的含有Fe2O3和铁酸盐颗粒的聚乙烯颗粒。这类磁性珠具有如下性质该珠被吸向磁铁。但一旦磁铁除去，磁性就消失，从而该珠转向。本专利技术所用磁珠的粒径为0.1μm-10μm。特别优选的范围是1μm-3μm，因为大小在该范围的珠对磁铁非常敏感。如下面所讨论的，一磁性珠与12-mers或无具体上限的挂出探针相连。可直接使用从生物中提取的DNA。当使用合成的探针时，从所需制备时间的角度考虑，其长度可为100-mers或更低。PCT(国际专利申请)公开未决WO86/07612叙述了碱基序列测定法;欧洲专利申请公开未决037369A2叙述了利用核酸外切酶和聚合酶扩增DNA的方法，其中用于延伸互补链的引物被核酸外切酶消化。但是，没有任何一篇文献提到过利用DNA探针对DNA进行高灵敏度检测的方法。附图说明图1显示了本专利技术的一个实施例中第一方法的流程;图2显示了本专利技术的一个实施例中第二方法的流程;图3显示了本专利技术的一个实施例中第三方法的流程;图4显示了利用连接反应的本专利技术另一实施例中第一方法的流程;在下面的实施例中，举例说明M13噬菌体的检测。本专利技术也可应用于病毒、细菌等的DNA。实施例1图1、2和3是对本专利技术第一、第二和第三方法的图解说明。第一方法DNA探针1由约20-mers寡核苷酸组成，它与5′末端以符号“＊”表示的荧光基团相连。这类标记荧光基团包括硫代若丹明101酰基氯(发射波长615nm)、FITC(荧光素异硫氰酸酯，发射波长520nm)以及其它能够与氨基相连的荧光基团。当复合DNA作为测试对象时，应改变标记荧光基团以改变由其发射的颜色，或者对组成DNA探针的核苷酸长度进行修饰，以检测和区分单个DNA。为了进行末端修饰，向靶DNA2和DNA探针1的混合物中加入DNA聚合物和化学修饰的二脱氧核苷酸(ddNTP-＊)3或核酸外切酶抗性的a-S-dNTP。对于这类化学修饰物质，优选那些即使与DNA聚合酶的反应被阻遏仍能促进这类末端修饰的物质，因此优选的是明显阻遏或抑制核酸外切酶消化作用的物质。这类物质的例子有但不限于硫代若丹明101或a-S-dNTP，上述性质可通过具有占据很宽空间的漏加原子基团的物质或通过能够形成不被酶促水解的结合位点的物质获得。也就是说，化学修饰物质包括硫代若丹明101、荧光素异硫氰酸酯、琥珀酰荧光素、四甲基若丹明以及通过连接荧光基团如生物素与ddNTP或与用于修饰的非水解核苷酸如a-S-二脱氧核苷酸三磷酸酯所产生的化合物。优选的是，DNA探针与靶DNA的杂交效力通过末端修饰而降低。例如，与琥珀酰荧光素(发射波长512nm)连接的ddNTP被插入DNA探针时，DNA探针的末端杂交效力下降，因为ddNTP趋向于与末端周围的核苷酸结合，且还因为该大分子与核苷酸相连。当在70-80℃的较高温度下促进与热稳定酶如Tag的反应时，出现杂交反应和脱杂交反应的平衡。结果，在某些情况下末端修饰的DNA探针5被释放，并且发生未修饰DNA探针1与靶DNA的杂并以进行化学修饰。即，未本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种利用ＤＮＡ探针检测ＤＮＡ的方法，它包括对杂交在靶ＤＮＡ或ＲＮＡ上的ＤＮＡ探针或ＲＮＡ探针的末端进行化学修饰的第一方法，消化或除去未反应的ＤＮＡ探针或ＲＮＡ探针的第二方法，以及检测在第一方法中进行化学修饰的ＤＮＡ探针或ＲＮＡ探针的第三方法。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：神原秀记，冈野和宣，川本和子，古山宏子，永井启一，
申请(专利权)人：株式会社日立制作所，
类型：发明
国别省市：JP[日本]